Ektomykorhizní symbióza

1. Ektomykorhiznísymbióza

2. Co to je ektomykorhiza? • Symbiotické spojení mezi houbou a rostlinou • Formuje se na fyziologicky aktivních laterálních kořínkách dřevin • Ektomykorhiza je morfologická formace, na jejímž vzhledu se podílí jak rostlina tak houba Houbový plášť Střední válec kořene kortex Kolonizace laterálních kořínků endodermis Hartigova síť

3. Houba kolonizuje úsek laterálního kořínku tak, že hyfami proniká do primární kůry kořene a v mezibuněčných prostorách tvoří myceliární síť nazývanou „Hartigova síť“. • Hartigova síť: u gymnospermních rostlin se formuje kolem a mezi buňkami kortexu (ale nepenetrují), angiospermních rostlin i u epidermálních buněk. • Na povrchu kořene se z hyf utvoří kompaktní povlak – hyfový plášť, který změní morfologii, anatomii a celkový vzhled kolonizovaného kořínku. • Ostatní struktury: extramatrikální hyfy, sklerocia, rhizomorfy, laktifery, cystidia… • Vyskytuje se, až na vyjímky, výhradně u dřevin

4. Je známo: cca: 2.000 druhů rostlin, které tvoří ektomykorhizu (Betulaceae, Dipterocarpaceae, Fagaceae , Myrtaceae, Pinaceae, Salicaceae) Cca 5.000 druhů hub, které tvoří ektomykorhizu Odd: Basidiomycota příklad: Agaricales: Amanita sp. Russulales: Russula sp, Lactarius sp. Boletales: Boletus sp., Paxillus sp. Gomphales: Ramaria sp. Cantharellales: Cantharellus sp. Polyporales: Polyporus sp, , Sistotrema sp., Hymenochaetales: Coltricia sp. Thelephorales: Thelephora sp. Odd: Ascomycota Tuberales: Tuber sp, Terfezia sp. Pezizales: Morchella sp., Genea sp., Helvella sp, Gyromitra sp. Elaphomycetales: Elaphomycetales sp. Mycelia sterila: Coenococcum sp.

5. Proč? • Rostlina poskytuje houbě: • sacharidy: udává se, že rostliny investujíaž 10% fotosyntetických produktůdo svého mykobionta • glukóza je enzymaticky houbou přeměněna na trehalozu, manitol a glykogen • pro houby jsou to transportní a zásobní látky, látky nezbytné ke klíčení spór • Houba poskytuje rostlině: • fosfor, vápník, draslík, mikroprvky • vodu • ochrana proti půdním patogenům (např.Phytopthora fragarie) • Zvyšuje aktivní povrch kořenů • Produkuje auxiny a gibereliny (rostlinné hormony)

7. Ze spór vyklíčí monokaryotické mycelium (Basidiomycety), které se mění (fúze a přezky) na dikaryotické (morfogeneze) aktivní mycelium, které aktivně (růstové tropismy)vyhledává hostitele, čerstvé aktivní kořínky. • Hyfa kontaktuje povrch, enzymaticky a mechanicky rozrušuje povrchové buňky a tvoří hyfální plášť. Tento proces je doprovázen řadou biochemických reakcí, jak ze strany houby tak ze strany rostliny. • Z hyfálního pláště se pak pojí množství externích hyf s půdním okolím kořínku vytváří tzv. aktivní zónu (několik mm kolem kořínku) • Hyfa penetruje a kolonizuje prostor kortexu (jehličnany) a epidermálních buněk (listnáče) a formuje Hartigovu síť • Rostliny po dobu formace ektomykorhizního spojení produkují polyfenoly a sekundární metabolity, jenž zvyšují jejich rezistenci proti půdním patogenům – houbám, bakteriím i hmyzu. • Houba sama o sobě má ještě tzv. bakteriální pomocníky (helper bacteria), které usnadňují kolonizaci kořene, podporují tvorbu postranních kořínků, mění architekturu morfotypu v závislosti na ECM druhu • Ektomykorhizní spojení na 1 laterálním kořínku je časově i prostorově omezené. Závisí na stáří a fyziologii laterálního kořínku. Hartigova sít postupně odumírá a hyfální plášť mění na základě metabolitů barvu a postupně odumírá (jedná se ale o jeden jediný morfotyp a současně se vždy tvoří mnoho nových současně s růstem dalších laterálních kořínků).

8. Výsledkem je: • že na kořeni 1 stromu se tvoří a zaniká množství ektomykorhiz, tvořené rozmanitými druhy hub • Kořínek může houbu přerůst a často bývá kolonizován více druhy ECMf • Na základě toho, jak jsou ECM houby dominantní v prostoru a čase rozlišujeme: • Ranně sukcesní druhy, pozdně sukcesní druhy a multisukcesní (early, late, & multi-stage) • Tvorba plodnic nesouvisí s tvorbou ECM, nemusí ovlivňovat dominanci druhu na kořenech dané dřeviny • Na základě biologické specifičnosti druhu (metabolity, biochemické aktivity, morfologie) je ektomykorhiza formovaná každým konkrétním rodem morfologicky odlišná – pozměňuje tvar a barvu kořínku – ektomykorhiznímorfotypy

9. Na čem závisí druhové spektrum ektomykorhizních hub? • Rostlina- druh, věk, fyziologický stav • Houba – druh, specifická vazba na hostitele, nutriční požadavky • Prostředí- typ půdy (moder - ektomykorhizní, mor – ekto, ektendo-, erikoidní), okolní vlivy – hnojení, sešlap, spady.. etc. Počasí – období vegetačního klidu pro dřeviny – omezená tvorba ektomykorhizních špiček, tenčí hyfální plášť apod. R čas prostředí H

10. Jak určím o kterou ektomykorhizní houbu se jedná? • Plodnice • Morfologické charakteristiky ECM morfotypu • Anatomické charakteristiky ECM morfotypu • Molekulární metody Hebeloma crustuliniforme

11. Metody identifikace ektomykorhiz • Binolupa + mikroskop • Kvalitativní určení – rod (druh) houby • Kvantitativní určení – procentické zastoupení druhu na celkové mykorhizaci, frekvence 1 druhu na definovanou délku kořene, celková mykorhizace kořene semenáčku • Molekulární metody – klasická PCR a přímé sekvenování – pro jednotlivé vybrané morfotypy (důležitý je volba sekvenovaného úseku – je lepší tzv. barcoding – výběr více genů tzn. rDNA ITS, EF1, cytB etc.) • Směsné vzorky – DGEE, pyrosekvenování • RT-PCR – kvantita ? i kvalita (druhové složení)

12. 1.Morfologie ECM špiček – morfotypy: určujeme pod binolupou, propláchnuté kořínky jsou zcela ponořené ve vodě v Petriho misce! • Větvení, délka, abundance, průměr mykorhizních špiček Nevětvené solitérní špičky (Coenococcum sp.) Monopodiálně pinátní (Russula nigricans)

13. Nepravidelněvětvené (Theleophora sp.) Koraloidní (Rhizopogon sp.)

14. 2. Zakončení nevětvených částí morfotypů:

15. 3. Povrch houbového pláště + barva Tomentella sp.

16. 4. Přítomnost ostatních struktur– rhizomorfy, extramatrikální hyfy (morfologie), cystidia, sklerocia, laktifery. Amphinema byssoides: Thelephorales

17. 5. Anatomie morfotypu:Hartigova síť a uspořádání buněk hyfálního pláště. – mikroskop

18. Anatomie pláště a Hartigovy sítě • Celková anatomie mykorhizy • Anatomie laktifer, hyf (přítomnost přezek, anatomóz, napojení hyf etc.) • Jednotlivých vrstev houbového pláště • Tvar a uspořádání buněk • (parenchymatické,pseudoparenchymatické) • 5. Přítomnost chlamydospór, haustorií Paxillus involutus - Hartigova síť • Využití autofluorescence v určité vlnové délce (UV filtr) • Chemické reakce (Fuchsin, anilin, síran železitý, Melzerovo reagens, sulfovanilin etc.)

19. Hyfa s přezkou

20. Zdrojem DNA v případě ECM bude: • Kořenová špička - očištěná • In vitro kultura (y) – získaná (é) z kořenové špičky

21. Výsledkem sekvenace by měla být jasně identifikovaná DNA v rámci amplifikovaného ITS úseku (nebo EF-alfa, cyt B tec), která na základě NCBI náleží konkrétnímu houbovému organismu (databáze). Optimální je pro identifikaci mykorhiz kombinovat metodu morfologického popisu a metodu molekulární identifikace.

22. Produkce ECM mycelia v substrátu • Přímé pozorování růstu mycelia v rhizotronu • Síťové pokusy – „mesch bags“ „mesch cages“ • Vyhodnocení: • ECM druhy – morfologie + molekulární metody • Explorační typy ECM (ekologicko-nutriční skupiny – produkce rhizomorf a emanačních hyf) • Kombinace s molekulárními metodami • Mycelium může být značeno izotopy – C4, chemickými markery • Množství mycelia se může vyhodnotit jako sušina • Enzymatické aktivity inokulovaných kořínků – fosfatázová aktivita, trehalózová,chitinázová aktivita – kolorimetricky, chromatografie, elektroforeticky • Identifikace a měření ergosterolu a fosfolipidů v substrátu (ve vzorku) • RT-PCR – metoda, při které je možné identifikovat množství a druhové složení ECM hub ve vzorku

23. Inokulační pokus

24. Scleroderma citrinum (Basidiomycota: Boletales) rhizomorfa

25. Laccariaamethystea Basidiomycota: Agaricales (Fagus sylvatica)

26. Řád: Theleophorales(plesňákotvaré) • Plodnice mohou být resupinátní až pileátní • Hymenofór – hladký, zubaté, porovité • Monomitický systém • Hyfy jsou tmavé, pigmentované • Zástupci jsou lignikolní druhy nebo mykorhizní

27. Coenococcum geophillum: Kmen: Ascomycota (melanizovaný povrch, R- strategové)

28. Lactarius blennius (Fagus sylvatica) laktifery

29. Fagirhiza spinulosa (Fagus sylvatica)