RNAi Ülo Maiväli ymaivali@ebc.ee

1. RNAiÜlo Maiväliymaivali@ebc.ee

2. RNAi kirjeldati esmalt (1989) taimedes kus transgeenide mitmete koopiate korraga genoomi viimine põhjustas vastava endogeense geeni post-transkriptsioonilist vaigistamist. Uurimise buum algas 1998 kui RNAi kirjeldati C. elegansis.

3. (1995) C. elegansi par-1 mRNAle antisense RNAd ekspresseerides blokeeriti ekspressioon. • Üllataval kombel sama lugu kui sense RNAd ekspresseeriti. • (1998) vaigistamine levib iduteede kaudu mitu generatsiooni ja samas loomas koest koesse • dsRNA palju parem vaigistamise induktor kui ssRNA

6. RNAi päästikud • dsRNA (viirused) • ssRNA (transposonid, transgeenid)- vajab RdRP-d

8. RNAi toimemehhanismid • Spetsiifiliste rakuliste RNAde lagundamine (siRNA, miRNA) • Spetsiifiliste rakuliste mRNAde translatsiooni inhibeerimine (miRNA) • Heterokromatiini teke ja hoidmine (miRNA)

10. Sõnaraamat • RNAi – RNA interferents • siRNA – small interfering RNA (eksogeenne, u 22nt) • miRNA – micro-RNA (endogeenne, u 22 nt) • shRNA – short haipin RNA (kunstlik) • rasiRNA – repeat associated short interfering RNA (endogeenne) • RISC – RNA-induced silencing complex • RITS - RNA-induced transcriptional silencing complex

12. 1. RdRP teeb ssRNA pikaks dsRNAks Toimub taimes, C. elegansis, Neurosporas. Ei toimu kärbses ega imetajas.

14. 2. RNaasIII-e tüüpi endonukleaas Dicer lõikab tsütoplasmas dsRNA 21-28 nt juppideks. primaarse miRNA prekursori lõikamine algab tuumas (Drosha), produkt läheb tsütoplasmasse (eksportiin 5 abil) kus Dicer miRNA valmis teeb. Mõlemad nukleaasid jätavad 5´ fosfaadi ja 2-nukleotiidise 3´-overhang-i. Reaktsiooni ATP sõltuvus segane. Kärbses 2 dicerit, Arabidopsises 4, C. elegansis, S. pombes ja imetajas 1. Erinevad dicerid võivad õra tunda erinevaid RNA tüüpe.

15. RISC sisaldab ainult ssRNA juppi Argonaut (Ago) valku – see on endonukleaas, mis degradeerib märklaud-RNA RNA helikaasid (?) RISCi suurus 130-160 kDa (kõrge soolaga puhastatud inimesest) kuni 80S-ni (kärbse lüsaadist) RISCi assambleerimine ATP-sõltuv, märklaua lõikamine ATP-sõltumatu Ago geene – S. pombes 1, C. elegansis üle 20: ei ole redundantsed 3. RISCi assambleerimine

16. 4. mRNA lagundamine ja translatsiooni repressioon • RISC (Ago) lõikab märklauda komplementaarse ala keskelt, ei vaja ATPd, vajab Mg++. • Et sama RISC saaks mitu korda lõigata on vaja ATPd. • miRNA translatsiooni repressioon seondumise kaudu 3´UTR-le, komplementaarsus madalam kui siRNA-de puhul tavaks.

19. miRNA • u 22 nt • Leitud kõigis hulkrakseis kus otsitud • Kärbses, ussis 100 geeni • Imetajas 250 miRNA geeni • Taimes paarduvad mRNA märklauaga vigadeta – viivad mRNA degradatsioonile • Loomades tavaliselt puudulik paardumine – translatsiooni inhibitsioon

24. Hea looma miRNA tunneb ära... • ... paardub märklaua 3´UTR-ga • ... Rohkem pidevat aluspaardumist leiab miRNA 5´-poolses osas • ...on fülogeneetiliselt konserveerunud

25. Hea looma miRNA märklaua tunneb ära ... • Kui tema 3´UTRis on mitu konserveerunud järjestust miRNAga paardumiseks

27. miRNA märklaud-mRNAd • Palju transkriptsioonifaktoreid • Kärbse miR-277: leu, ile, val katabolismi geenid • Rakuproliferatsiooni kontrollirajad

32. RNAi ja heterokromatiini vaigistamine • 1928 Heitz – heterokromatiid on kromosoomi osa, mis jääb läbi rakutsükli kondenseerunuks • Koosneb põhiliselt kordusjärjestustest ja transposonitest (tsentromeer, telomeeri ümbrus) • Kärbses vaigistab hetrokromatiidi lähedus silmavärvi geeni – position effect variegation (PEV)

35. Vaigistatud heterokromatiin... • ... Hoiab ära rekombinatsiooni ja sellega seoses kromosoomi ümberkorraldusi • ... Vaigistab transposoneid

36. Heterokromatiini tekitab ... • ... Histooni H3 lys 9 metülatsioon (H3mK9) H3mK9 tunneb ära hetero-chromatin protein 1 (HP1) • ...Tsütosiini metülatsioon DNAs (puudub või p a puudub pärmis, kärbses, nematoodis) H3mK9 ja Cm on omavahel funktsionaalses seoses, mõlemad seotud RNAi mehhanismiga

37. S. pombe • S. pombes ago-, dcr- ja rdp- tüved elavad kuid ei suuda vaigistada tsentromeersesse DNAsse pandud reportergeene • RITS puhastatud heterokromatiinist, sisaldab Ago, Chp1 (heterokromatiini valk, seob H3mK9), Tas3 (tundmatu funktsioon) • siRNA toob ka RdRP tsentromeerile

38. Paljud RNAi-ks vajalikud geenid vajalikud ka transposonite vaigistamiseks C. elegansis, kärbses ja trüpanosoomis. • Paljud siRNAd vastavad tsentromeeri kordusjärjestustele • Arabidopsise endogeensetest siRNAdest 90-95% vastab heterokromatiini transposonitele ja kordustele. • Samas vaigistamine sageli redundantne protsess – RNAi ei ole ainuke vahend

39. S. pombe tsentromeersed kordused transkribeeritakse ja protsessitakse kiiresti siRNAdeks • siRNA amplifikatsioon RdRP poolt • siRNA viib RITSi kohale • Clr4 teeb H3mK9 • RITS toob kohale Swi6 (HP1 homoloog, mis vaigistab kromatiini)

40. Arabidopsis hetrokromatiini aitavad moodutada 3 geenigruppi, mille produktid võivad komleksi moodustada: • DRM1&2 on metüültransferaasid (non-GC) • CMT3 on metüültransferaas (GCN), mille toob kohale H3mK9 • MET1 metüültransferaas (GC)

41. RNAi inimese rakuliinides • Transvekteeri sünteetilisi siRNAsid- transientne kuid lihtne ja odav • dsRNA rakku vektorilt kus RNA pol III alt sünteesitakse lühikest juuksenõela struktuuriga RNAd (shRNA)- pikaajaline kuid keerulisem disainida • Olemas 2 raamatukogu u 10 000 valitud inimese geeni vastu suunatud shRNAga, neist ühe puhul on olemas ka u 5000 shRNA konstrukti vastavate geenide hiire ortoloogide vastu

42. Probleemid: • Nii siRNA kui shRNA võib vahest PKR-i aktiveerida • Kui siRNA otsa jääb 5´-trifosfaat, aktiveeritakse interferooni vastus • Suur kogus siRNAd viib vastuse spetsiifika alla

44. dsRNA imetajas