1 / 36

Plūsmas citometrija

Arnis Strods 01.11.2013. Plūsmas citometrija. Plūsmas citometrija. Tehnika mikroskopisku daļiņu saskaitīšanai un analizēšanai, suspendējot tās šķidruma plūsmā un analizējot šādu plūsmu ar dažādiem detektoriem. Asins šūnas. Hromosomas. Aļģes. Protozoji.

havily
Download Presentation

Plūsmas citometrija

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Arnis Strods 01.11.2013. Plūsmas citometrija

  2. Plūsmas citometrija Tehnika mikroskopisku daļiņu saskaitīšanai un analizēšanai, suspendējot tās šķidruma plūsmā un analizējot šādu plūsmu ar dažādiem detektoriem. Asins šūnas Hromosomas Aļģes Protozoji Plūsmas citometrija (Flow cytometry) Cytos=šūna; metria=mērījums (no latīņu val.)

  3. Nedaudz vēstures • 1934 - pirmais mēģinājums šūnu skaitīšanai plūsmā - Andrew Moldavan • 1963 - pirmais analītiskais instruments • Komerciāli pieejami plūsmas citometri kopš 1970tajiem gadiem

  4. ...un slavas • Mūsdienu plūsmas citometri spēj analizēt vairākus simtus tūkstošu šūnu dažu sekunžu laikā Priekšrocība salīdzinājumā ar tradicionālajām mikroskopijas metodēm Phywe AG of Gottingen – 1969 Pirmais komerciālais plūsmas citometrs, kas uzbūvēts ap Zeiss fluorescento mikroskopu

  5. Pielietojuma iespējas • Šūnu virsmas raksturošana • Šūnu ploīdijas noteikšana • Šūnas cikla pētījumi • Intracelulārā Ca++ līmeņa noteikšana • Membrānas potenciāla mērījumi • pH mērījumi • Mitohondriju funkcionalitātes novērtēšana • u.c.

  6. Plūsmas citometrs

  7. Sistēmas uzbūve Sistēmas pamatdaļas: • Plūsma • Optika • Elektronika BD FACSAria II

  8. Plūsma parauga iešprices kamera Nesējšķīduma trauks zem spiediena filtrs Nesējšķīdumaplūsma Paraugaplūsma (Suspensija – monodispersa sistēma) mēģene ar paraugu Flow Cell mijiedarbībaspunkts atsevišķi pilieni mēģenes vai plate savākšanai atkritumu trauks

  9. Plūsma Sheathplūsma Sheathplūsma Sheathplūsma Sheathplūsma parauga plūsma parauga plūsma lāzeru stari lāzeru stari zems parauga spiediens augsts parauga spiediens Hidrodinamiskā fokusēšana – process, kas fokusē parauga plūsmu nesējšķīdumā (sheath)

  10. Plūsma parauga pievads sheath fluid pievadi

  11. Optika Focuslenses Optical fibers Prisms 1 optical fiber per laser > 670 nm Red Laser (635 nm) Flow Cell 564–606 nm Blue Laser (488 nm) Violet Laser (405 nm) SSC 515–545 nm 750–810 nm

  12. Bazofilais granulocīts Eozinofilais granulocīts Šūnu īpašības 7 – 10 mm T šūna 10 – 15 mm Monocīts Eritrocīti Neitrofilais granulocīts 10 – 20 mm

  13. Sānu izkliede Side scatter (SSC)Granularitāte(488 nm) • Side scatter(SSC) • mēra 90O leņķī no ienākošās gaismas • proporcionāla šūnu «kompleksumam» (granularitātei) Gaismas izkliede Izkliede uz priekšu Forward scatter (FSC)Šūnu izmērs (488 nm) Koherents gaismas avots (488 nm) • Forward scatter (FSC) • mēra pa ienākošās gaismas asi • proporcionāls šūnu izmēram / šūnu virsmai (tikai ideāli apaļām šūnām)

  14. Asins šūnas pēc gaismas izkliedes

  15. O HO = 488 nm 520 nm C Ierosinošā gaisma CO2H Emitētā fluorescences gaisma Fluorohroma molekula Antiviela Fluorescentās iezīmes Fluorescence - process, kurā ķīmisks savienojums emitē gaismu pēc gaismas vai cita elektromagnētiskā starojuma absorbcijas. Fluorohroms – absorbē ienākošās gaismas enerģiju. Atbrīvo absorbēto enerģiju: - ar vibrāciju un izkliedē siltumu - emitē fotonu ar lielāku viļņa garumu (mazāku enerģiju)

  16. 350 457 488 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorohromi, spektri PE-TR Conj. Ierosinošie lāzeri Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid

  17. FACSAria lāzeri BMC • Zilais (488nm) • Sarkanais (633nm) • Violetais (408nm)/nearUV (375nm) Katram fluorohromam raksturīgs konkrēts optimālais ierosināšanās gaismas diapazons. Svarīgi iepazīties ar pieejamā instrumenta iespējām... Stokes Shift is 25 nm Fluorescein molecule 520 nm 495 nm Fluorescnece Intensity Wavelength

  18. Šūnu iezīmēšana Iespēja paraugā izšķirt specifiskas šūnu populācijas, kas ekspresē interesējošos marķierus Liu et al., 2005. Mining the complement system for lupus biomarkers. Clinical and Applied Immunology Reviews

  19. FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Notikumu skaits 101 102 103 104 Relatīvā fluorescences intensitāte Fluorescences intensitāte Fluorescences intensitāte ir proporcionāla pie šūnām saistīto antivielu skaitam: Pozitīvā populācija Negatīvā populācija

  20. Fluorescences detekcija Savāktā fluorescences gaisma Filtru veidi:

  21. Optika

  22. Elektronika 2 2 3 1 3 1 V e- e- Pulse Time ~ 3.2 s Time ~ 3.2 s 1 2 Time ~ 3.2 s 3 • Gaismas signāli tiek pārvērsti elektroniskā signālā ar fotodetektoru palīdzību: • Fotodiode – spēcīgāka signāla uztveršanai (FSC fotodiode) • Fotopavairotājs (PMT - PhotoMultiplier Tube) – vājāku signālu detekcijai (SSC un fluorescences signāli)

  23. Elektronika PMT tuvākā skatā:

  24. Elektronika Impulsa veidošanās

  25. Elektronika Galvenie datu attēlošanas veidi: «Dot plots» Histogramma

  26. Datu analīze Citas brīvpieejas programmas: • WinMDI, FlowJo, WinList, Weasel • CyFlogic • Infinicyt • Flowing Software • ...un arī Excel FACSAria izmanto FACSDiVa programmatūru un datus var saglabāt FCS 2.0 vai FCS 3.0 failu veidā

  27. Šūnu šķirošana • FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting Plūsmas citometrijas viens no variantiem, kad iespējams šūnas ne tikai kvantitatīvi un kvalitatīvi detektēt, bet arī pēc šīm īpašībām fiziski atdalīt vienu no otras.

  28. 6. Tiek savākti lādētie pilieni, kas satur interesējošās daļiņas Šūnu šķirošana - princips 2. Tiek pielikts spriegums pjezokristālam (Vibrācija ar frekvenci 90000 Hz/s – tik pat daudz pilienu veidojas sekundes laikā!) • Paraugs ģenerē gaismas izkliedi un fluorescentos signālus. Tiek pieņemts lēmums, balstoties uz šķirošanas stratēģiju 3. Atdalās lādēti pilieni 4. Deflekcijas plātnes pievelk vai atgrūž lādētos pilienus 5. Nelādētie pilieni nonāk atkritumos Plūsmu iespējams sadalīt 2 vai 4 daļās

  29. Šūnu šķirošana - princips

  30. Šūnu šķirošana – princips Un šādi dabā

  31. Šūnu šķirošana • Šķirot iespējams: stobriņos – 2 vai 4 virzienos reizē

  32. Šūnu šķirošana • Šķirot iespējams: stobriņos – 2 vai 4 virzienos uz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu • Šķiro tikai 1 populācijuuzreiz • Var nodefinēt: • dažādas populācijas bedrītēs • precīzu šūnu skaitu bedrītē • Precizitāte 99%

  33. Šūnu šķirošana • Šķirot iespējams: stobriņos – 2 vai 4 virzienos uz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu uz mikroskopa slaidiem Izkārtojums uz slaida:

  34. Šūnu šķirošana • Šķirot iespējams: stobriņos – 2 vai 4 virzienos uz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu uz mikroskopa slaidiem custom device – nodefinējam savu izkārtojumu uz kaut kā ko var uzlikt uz plašu paliktņa, piemēram, petri trauks, apakštasīte, utt.utjp. (max – 25 kolonnas, 60 rindas)

  35. ??? Arnis Strods a.strods@biomed.lu.lv

  36. Dalāmies!

More Related