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蛋白质的定量测定. Ⅰ 微量凯氏定氮法 Ⅱ Folin- 酚试剂法 Ⅲ 紫外光吸收法. Ⅰ 微量凯氏定氮法. 一、目的要求 ⒈ 掌握微量凯氏定氮法的原理和计算方法 ⒉ 初步掌握此法的操作技术及应用. Ⅰ 微量凯氏定氮法. 二、实验原理 蛋白质的主要组成元素 C,H,O,N,S ，各种蛋白质中含氮量恒定在 13%-19% ，平均为 16% 。每 100 克蛋白质中含氮约为 16 克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。 蛋白质含量 = 含氮量 ×6.25. 怎样测定有机含氮物（生物组织）中的氮
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蛋白质的定量测定 Ⅰ 微量凯氏定氮法 Ⅱ Folin-酚试剂法 Ⅲ 紫外光吸收法
Ⅰ 微量凯氏定氮法 一、目的要求 ⒈ 掌握微量凯氏定氮法的原理和计算方法 ⒉ 初步掌握此法的操作技术及应用
Ⅰ 微量凯氏定氮法 二、实验原理 蛋白质的主要组成元素C,H,O,N,S，各种蛋白质中含氮量恒定在13%-19%，平均为16%。每100克蛋白质中含氮约为16克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。 蛋白质含量=含氮量×6.25
怎样测定有机含氮物（生物组织）中的氮 ⑴ 消化：将高分子的蛋白质消化成小分子的无机物，把有机氮转变为无机氮 含氮有机物（血清）+H2SO4(浓) → (NH4)2SO4+ CO2↑+ SO2↑+H2O↑ 加CuSO4作催化剂， k2SO4提高沸点，样品中的C,H,O,S全部氧化成CO2、 SO2、H2O挥发掉，有机氮转变为氨并与硫酸结合生成硫酸铵
⑵ 蒸馏：(NH4)2SO4+NaOH(过量) →2NH4OH（NH3↑+H2O）+Na2SO4 ⑶ 吸收( 硼酸中加指示剂）：2%硼酸吸收全部氨 NH3 +H3BO3(过量) → (NH4)3BO3 ⑷ 滴定：(NH4)3BO3+3HCl→3NH4Cl+H3BO3 用0.01mol/L的HCl滴定，1molHCl相当于1molN 滴定指示剂：甲基红+髹甲酚绿按1：5混合 pH﹤4.2-5.4 红色 4.2-5.4 紫灰色（滴定终点） pH﹥4.2-5.4 蓝色
三、操作步骤 ⒈ 样品空白蒸馏：取50-10mL锥形瓶两只，标明空白、测定，于两瓶中分别加入2%硼酸10mL，混合指示剂2滴。溶液呈紫灰色。 ⒉ 将冷凝管下端插入吸收瓶的硼酸指示剂混合液中 ⒊ 通过小漏斗将消化液倾入反应室中（用蒸馏水将消化管洗3-4次并将洗液逐次倾入反应室中） ⒋ 再由小漏斗加50%NaOH7mL，将有关夹子关闭，酒精灯加热，使蒸汽进入反应室
⒌ 观察吸收瓶中的硼酸由紫灰变成蓝色，自变色时起，继续整馏3分钟，然后将吸收瓶降低，使冷凝管离开液面1cm，再蒸馏1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端，蒸馏完毕。取下吸收瓶，随即将蒸馏器洗净 ⒍ 滴定：以0.01mol/L盐酸滴定吸收瓶中溶液，直至硼酸指示剂显出紫灰色为止。记下HCl用量。 ⒎ 计算：样品含氮量： 1mL0.01mol/L HCl≈0.14mgN 血清总氮量(mg/100mL) = (A-B) ×0.14 ×100 血清mL数 A-测定管 B-空白管 血清蛋白质含量(g/L)=血清含氮量 ×6.25×10/1000
四、意义 ⒈ 本法是测定有机物中含氮量的经典方法，结果准确可靠 ⒉ 可用于测定食物、血清、尿液等样品中蛋白质含量（过程繁琐，不常用） ⒊ 用于校正标准蛋白质溶液的浓度 ⒋ 一般样品中含有非蛋白氮，须排除，适用于测定微量的蛋白质含量。
Ⅱ Folin-酚试剂法 一、原理 蛋白质分子的肽键结构在碱性环境中能与Cu2+络合成紫色络合物（双缩脲反应），但络合物颜色浅，吸光度不易测出，故灵敏度低。 由于形成络合物后，蛋白质的肽链展开，使其中的酪氨酸等残基充分暴露，而蛋白质中酪氨酸的酚基在碱性条件下与酚试剂（磷钨酸-磷钼酸化合物）反应，使高价的Mo6+和W6+还原生成低价的钼离子和钨离子，呈铜蓝及钨蓝的颜色，蓝色的深浅与蛋白质含量成正比。在一定范围内符合L-B定律（20-300μg/mL）
注意：蛋白质中酪氨酸含量不同，生色强度不同，所以使用同种蛋白质（同源Pr)作标准，灵敏度比双缩脲反应高100倍注意：蛋白质中酪氨酸含量不同，生色强度不同，所以使用同种蛋白质（同源Pr)作标准，灵敏度比双缩脲反应高100倍
二、实验操作（取7支干净的大试管编号操作）二、实验操作（取7支干净的大试管编号操作）
三、结果 ⒈根据标准管的蛋白含量和吸光度，绘制标准曲线（以相当于每升血清中Pr的克数为横坐标，吸光度(A)为纵坐标 ⒉计算: 选一个和6管吸光度相近的标准管为标准， 血清Pr含量(g/L)= 6号管吸光度 ×标准管Pr含量× 1000 ×10-6 标准管吸光度 0.002
Ⅲ 紫外光吸收法 一、目的要求： ⒈ 掌握紫外光法测定蛋白质含量的原理及应用 ⒉ 了解测定方法 二、原理 由于含有酪氨酸和色氨酸，大多数Pr在280nm处有一明显吸收峰， 可利用此快速灵敏地测定Pr浓度。由于Pr样品中经常杂有核酸，对280nm光波也有吸收，但不如260nm光波吸收强，可通过统计计算，排除测定Pr含量时核酸的干扰。
三、计算 CP(mg/mL) = F×1/d×A280 F-校正因子 or CP(mg/mL) = 1.45×A280 – 0.74×A260 (经验公式） 四、优点及缺点 优点：⒈ 灵敏度高，20-100 μg/mL ⒉ 方法简单 ⒊ 盐类干扰少 ⒋ 蛋白质不需处理，可回收
缺点：对于测定与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量差异较大的蛋白质有一定误差，故适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。缺点：对于测定与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量差异较大的蛋白质有一定误差，故适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
