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运动生物化学实验

运动生物化学实验. 河南师范大学体育学院 翟鹏飞博士. 实验一 血乳酸的测定. 原理. 乳酸是人体内糖原或 葡萄糖 无氧酵解的最终产物 。 正常生理情况下，乳酸的生成与消除处于动态平衡。安静时运动员血乳酸浓度与常人无异。剧烈运动时，肌肉内糖无氧分解加剧，血乳酸浓度显著升高，其升高幅度与运动强度、训练水平等有关。因此，运用血乳酸指标可以评定运动员无氧和有氧代谢能力，控制运动强度，预测成绩，评定顺练效果等。. 原理.

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运动生物化学实验

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Presentation Transcript

  1. 运动生物化学实验 河南师范大学体育学院 翟鹏飞博士

  2. 实验一 血乳酸的测定

  3. 原理 • 乳酸是人体内糖原或葡萄糖无氧酵解的最终产物。正常生理情况下，乳酸的生成与消除处于动态平衡。安静时运动员血乳酸浓度与常人无异。剧烈运动时，肌肉内糖无氧分解加剧，血乳酸浓度显著升高，其升高幅度与运动强度、训练水平等有关。因此，运用血乳酸指标可以评定运动员无氧和有氧代谢能力，控制运动强度，预测成绩，评定顺练效果等。

  4. 原理 • 去除血液中蛋白质后，乳酸与浓硫酸共热生成乙醛，当铜离子存在时，乙醛与对羟基联苯作用生成紫红色化合物，其颜色深浅与乳酸浓度成正比，通过比色求其含量。 H2SO4 CH3CH(OH)COOH CH3CHO HCOOH + 乳酸 乙醛 甲酸 - H2O 乙醛 + 对羟基联苯 紫红色化合物

  5. 仪器 1、离心机；2、分光光度计；3、恒温水槽；4、移液管、滴管。

  6. 试剂 1、氟化钠溶液：称取氟化钠10.0g，蒸馏水溶解并定容至至100.0ml； 2、三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸10.0g，用蒸馏水溶解并定容至至100.0ml； 3、浓H2SO4（G.R，比重：1.838）； 4、硫酸铜溶液：称取无水硫酸铜8.0g，用蒸馏水溶解并定容至200.0ml； 5、对羟基联苯试剂：将1.5g对羟基联苯溶于10ml的5％NaOH溶液中，待溶解后加水稀释至100ml，储于棕色滴管试剂瓶中。

  7. 试剂 6、乳酸空白液：取1％氟化钠溶液和10％三氯乙酸溶液按1׃3（V/V）混匀； 7、乳酸标准储存液：精确称取L-乳酸锂192.0mg，溶于约10ml蒸馏水中，加H2SO4（浓）2滴，用蒸溜水定容至100ml，4ºC保存； 8、乳酸标准应用液（2.0mmol/l）：准确量取乳酸标准储存10.0ml，用蒸溜水定容至100ml，即用即配。 标本 血液

  8. 方法与步骤 一、无蛋白清液制备 1、取离心管； 2、1%氟化钠 0.48ml； 3、血浆0.02ml； 4、加10%三氯醋酸1.5ml，混匀，3000r/m，10min。

  9. 方法与步骤 二、显色 1．取3只试管，分别标注：测定管、标准管、空白管 。

  10. 计算结果 式中，AX：为测定管吸光度； As：为乳酸标准管吸光度； Cs ：为乳酸标准(工作)液浓度。 AX 乳酸浓度mmol/l=———×CS×100 AS

  11. 实验二 乳酸脱氢酶的测定 （比色法） 运动生物化学实验课件

  12. 原理 • L-乳酸和NAD+在乳酸脱氢酶（LDH）的催化作用下，生成丙酮酸和NADH。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙（红色化合物）。在一定范围内，红色深浅与丙酮酸的浓度成正比，与经同样处理丙酮酸标准液比色，即可求出血LDH的活力。 乳酸+ NAD+   LDH pH 8.8-9.8   丙酮酸+ NADH 丙酮酸+ 2,4-二硝基苯肼OH－丙酮酸-2,4-二硝基苯腙（红色化合物）

  13. 仪器 1、容量瓶；2、分光光度计；3、恒温水槽；4、移液管、滴管。 。

  14. 试剂 1、底物缓冲液（0.3mol/l 乳酸锂pH8.8）：称取二乙醇胺2.1g，乳酸锂2.9g，溶于80ml蒸馏水中，加入1mol/l盐酸调节pH值到8.8，定容于100ml； 2、NAD液（11.3mol/l）：称取磷酸肌酸钠（C4H8O5-O4PNa·6H2O）436mg，蒸馏水定容于2ml，4ºC保存； 3、丙酮酸标准液（0.5mol/l）：称取丙酮酸钠11mg，以底物缓冲液溶于80ml并定容于100ml；即配即用； 4、2,4-二硝基苯肼溶液（1mol/l）：称取2,4-二硝基苯肼198mg，加4mol/l盐酸250ml溶解后，蒸馏水定容于1000ml，置棕色瓶，室温保存； 5、氢氧化钠溶液（0.4mol/l）：称取氢氧化钠8.0g，蒸馏水定容于500ml，置塑料瓶保存。 标本 血液

  15. 方法与步骤 一、绘制标准曲线。

  16. 二、 比色法LDH活力测定的操作步骤

  17. 结果 测定管吸光度值减去对照管吸光度值即为待测样品的吸光度值，剧此值在标准曲线上查的乳酸脱氢酶活力。 LDH活力单位定义：100ml血清在37ºC作用下15分钟，生成1μmol的丙酮酸定义为1个金氏单位（U）。

  18. 实验三 肌酸激酶的测定 运动生物化学实验课件

  19. 原理 磷酸肌酸（CrP）和二磷酸腺苷（ADP）在肌酸激酶（CK）的作用下生成肌酸（Cr）和三磷酸腺苷（ATP）。与双乙酰及α—萘酚结合生成红色化合物。在一定范围内，红色深浅与肌酸量成正比，以此可以求得血清中CK活性。Mg2+为激活剂，半胱氨酸供给巯基，氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。 CrP + ADP    CK pH 6.7   Cr + ATP Cr + α-萘酚+ 双乙酰Mg2+   红色化合物

  20. 仪器 1、分光光度计；2、分析天平；3、恒温水浴；4、离心机；5、移液器；6、试管及试管架；7、烧杯；8、容量瓶。 。

  21. 试剂 1、底物溶液 A液（Tris-HCL缓冲液pH7.4）：称取Tris 2.42g，溶于100ml蒸馏水中，加入0.2mol/l盐酸88.8ml，无水硫酸镁0.34g，调节pH值到7.4，室温保存； B液（Tris-HCL缓冲液pH7.4）：称取磷酸肌酸钠（C4H8O5-O4PNa·6H2O）436mg，蒸馏水定容于100ml中，-25ºC保存； C液（ADP溶液0.004mol/L）：称取ADP钠盐233mg，蒸馏水定容于100ml中，-25ºC保存； 临用前，A液、B液、C液等体积混合。取此混合液9ml，加入盐酸半胱氨酸31.5mg， 调pH到7.4，即底物溶液；2-8ºC保存，即配即用；

  22. 试剂 2、终止液 D液（50g/L硫酸锌溶液）：称取硫酸锌（ZnSO4·7H2O）5g，蒸馏水定容于100ml； E液（60g/L氢氧化钡溶液）：称取氢氧化钡（Ba(OH)2·8H2O）6g，蒸馏水定容于100ml；煮沸数分钟，冷却后蒸馏水定容至100ml，过滤后去上清备用； 上述D液、E液配合后，吸取50g/L硫酸锌溶液5ml入三角瓶，加酚酞试剂2滴，用60g/L氢氧化钡溶液滴定，至出现粉红色，且30秒不退色。剧滴定结果，蒸馏水稀释氢氧化钡溶液，使稀释后的氢氧化钡溶液恰好与等体积的硫酸锌溶液中和；

  23. 试剂 3、肌酸标准液（1.7mmol/L）：称取无水肌酸（A.R.）22.3mg，蒸馏水定容于100ml；4ºC保存； 4、双乙酰溶液（0.5g/l）：称取双乙酰1.0g，蒸馏水定容于10ml，置棕色瓶4ºC保存；临用时蒸馏水20倍稀释； 5、贮存碱溶液：称取氢氧化钠30g，无水碳酸钠64g，蒸馏水定容于500ml中，置塑料瓶保存；如有沉淀37ºC溶解后使用； 6、α-萘酚溶液：称取α-萘酚400mg，以贮存碱溶液溶解、定容于10ml，即用即配。 标本 血清。

  24. 试剂 6、乳酸空白液：取1％氟化钠溶液和10％三氯乙酸溶液按1׃3（V/V）混匀； 7、乳酸标准储存液：精确称取L-乳酸锂192.0mg，溶于约10ml蒸馏水中，加H2SO4（浓）2滴，用蒸溜水定容至100ml，4ºC保存； 8、乳酸标准应用液（2.0mmol/l）：准确量取乳酸标准储存10.0ml，用蒸溜水定容至100ml，即用即配。 标本 血液

  25. 方法与步骤 速率法测定血肌酐的操作步骤

  26. 计算结果 Ax：测定管吸光度； AC：对照管吸光度； As：标准管吸光度； Cs：标准管肌酸浓度（mmol/l） T：反应时间（h） V：血清用量（ml） CK活力单位定义：一毫升血清在37ºC，生成1μmol的肌酸定义为1个肌酸激酶活力单位（U），此单位值乘以16.7即国际单位（U/L）。

  27. 实验四 血肌酐浓度的测定（苦味酸速率法） 运动生物化学实验课件

  28. 碱性溶液 原理 肌酐 + 苦味酸 肌酐-苦味酸加成物 （橙红色） • 血清经除蛋白处理后，肌酐与碱性苦味酸反应，生成红橙色的苦味酸肌酐复合物，在510 nm测定吸光度，其显色程度与肌酐含量成正比。与经同样处理肌酐标准液比色，即可求出血肌酐浓度。

  29. 仪器 • 1、分光光度计；2、分析天平；3、恒温水槽；4、移液器；5、试管及试管架；。

  30. 试剂 1、苦味酸溶液（0.04mol/l）：称取苦味酸9.164g，溶于500ml 80ºC蒸馏水中，冷却至室温后，蒸馏水稀释至900ml。以酚酞为指示剂，0.1mol/l氢氧化钠滴定，直至出现红色，蒸馏水定容至1000.0ml，置于棕色瓶内； 2、氢氧化钠溶液（0.32mol/l）：称取氢氧化钠12.803g，蒸馏水溶解、定容至1000.0ml； 3、碱性苦味酸溶液：将苦味酸溶液（0.04mol/l）与等体积的氢氧化钠溶液（0.32mol/l），加入1/500体积的Triton X-100，即用即配； 4、肌酐标准储备液（10mmol/l）：称取肌酐113.0mg，用0.1mol/l盐酸50ml溶解后，用0.1mol/l盐酸定容至100ml，2-8ºC保存； 5、肌酐标准应用液（100μmol/l）：量取1.00ml标准储备液，用0.1mol/l盐酸定容至100ml，2-8ºC保存。 标本 血清。

  31. 试剂 6、乳酸空白液：取1％氟化钠溶液和10％三氯乙酸溶液按1׃3（V/V）混匀； 7、乳酸标准储存液：精确称取L-乳酸锂192.0mg，溶于约10ml蒸馏水中，加H2SO4（浓）2滴，用蒸溜水定容至100ml，4ºC保存； 8、乳酸标准应用液（2.0mmol/l）：准确量取乳酸标准储存10.0ml，用蒸溜水定容至100ml，即用即配。 标本 血液

  32. 方法与步骤 带塞试管3支，编号，按下表操作： 速率法测定血肌酐的操作步骤

  33. 计算 [肌酐]（μmol/l）= ×Cs Ax1- Ax2 As1- As2 Ax1：测定管吸光度（第一次测量）； Ax2：测定管吸光度（第二次测量）； As1：标准管吸光度（第一次测量）； As1：标准管吸光度（第二次测量）； Cs：标准管肌酐浓度（mmol/l）； [肌酐]：测定管肌酐浓度（μmol/l）。

  34. 实验五 血清总胆固醇测定（COD-PAP法） 河南师范大学体育学院 运动生物化学实验课件

  35. 游离胆固醇(FC) 胆固醇酯酶 胆固醇氧化酶 过氧化物酶 3.胆固醇+O2 3.2H2O2＋4-氨基安替比林＋苯酚 苯醌亚胺非那腙＋4H2O 胆烷-4-稀-3-酮＋ H2O2 2、胆固醇酯 游离胆固醇 ＋ 游离脂肪酸 1、血清总胆固醇(TC) 37℃水浴 37℃水浴 胆固醇酯(CE) 实验原理 (红色，500nm波长)

  36. 仪器 1、恒温水槽；2、分光光度计；3、滴管；4、移液管、。

  37. 试剂 1、酶试剂：4-羟乙基哌嗪乙磺酸75mmol/l；MgSO410mmol/l； 胆酸钠3.0mmol/l；4-氨基安替比林0.5mmol/l；苯酚5.0mmol/l；CEH＞800U/L；COD ＞500U/L；POD ＞1000U/L；聚氧乙烯类表面活性剂3g/l；pH7.4； 2、TC标准液：胆固醇5.17mol/l。 标本 血清。

  38. 方法与步骤 取3只试管，分别标注：测定管、标准管、空白管。

  39. 计算结果 式中，AX：为测定管吸光度； As：为乳酸标准管吸光度； Cs ：为乳酸标准(工作)液浓度。 AX 乳酸浓度mmol/l=———×CS×100 AS

  40. 混匀，37oC保温6分钟 • 在试管中加入1ml蒸馏水 • 500nm波长比色，空白管调零，读出吸光度 • 计算： A测定 × 5.17mmol/L 血清TC(mmol/L)= A标准 兔血清TC参考值：0.77～2.00 mmol/L

  41. 注意事项 1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致； 2、试管在操作前尽量保持干燥； 3、比色应及时，30min内完成； 4、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去 掉胆固醇酯酶即可。

  42. 实验六 血氨（NH3）浓度的测定（GLDH法） 氨是氨基酸的代谢产物。血氨增多，表明体内蛋白质分解增多，氨含量可以反映机体内蛋白质的分解程度，对血氨的分析可以客观了解机体的运动机能，对指导运动训练具有重要的现实意义。 运动生物化学实验课件

  43. 氨在GLDH催化下，与α-酮戊二酸和NADPH反应生成谷氨酸和NADP+，测定NADPH在340 nm处吸光值的变化值。即可计算出氨的含量。 NH3→NH4++ α-酮戊二酸+NADPH 原理 GLDH 谷氨酸 + NADP+

  44. 仪器 1、分光光度计；2、分析天平；3、恒温水槽；4、移液器；5、试管及试管架；。

  45. 试剂 1、无氨蒸馏水：全玻璃蒸馏器中加入，蒸馏水2000.0ml，2.0mmol/l硫酸0.25ml/，10.0g/l高锰酸钾2.0ml； 蒸馏，弃起始和终末端，收集中段蒸馏水； 2、磷酸盐缓冲液（66.7mol/l，pH 8.3）：取无水磷酸二氢钠11.5g；无水磷酸二氢钾0.3g；溶于1000ml蒸馏水中，调Hp至8.3，2-8ºC保存； 3、L-α-酮戊二酸溶液（310mmol/l）：取L-α-酮戊二酸0.353mg；溶于5ml无氨蒸馏水中，调Hp至6.8，无氨蒸馏水定容到10.0ml，2-8ºC保存； 4、NADPH储液（13mmol/l）： NADPH 20mg；定容于2ml磷酸盐缓冲液，2-8ºC保存；

  46. 试剂 5、GLDH工作液（GLDH 2000U/L，NADPH 0.15mmol/l，ADP 0.6mmol/l，）：取ADP 30mg；溶于80ml磷酸盐缓冲液（66.7mol/l，pH 8.3），加入GLDH 200U，NADPH储液1.154ml，磷酸盐缓冲液定容到100.0ml，2-8ºC保存； 6、氨标准储液（10.0mmol/l）：取干燥至恒重的硫酸铵660.7mg；溶于100ml无氨蒸馏水，加入氯仿数滴，2-8ºC保存； 7、氨标准工作液（100.0μmol/l）：取1mlg氨标准储液（10.0mmol/l）；定容于100ml无氨蒸馏水，2-8ºC保存。 标本 血浆。

  47. 方法与步骤 取3只试管，分别标注：测定管、标准管、空白管。

  48. 计算结果 AX：为测定管吸光度变化值； As ：为标准管吸光度变化值； Cs ：为标准管氨的浓度。 AX AS [血氨]（μmol/l）= ×CS

  49. 实验七 血清尿素浓度的测定（二乙酰一肟法） 运动生物化学实验课件

  50. 原理 二乙酰不稳定，故通常用二乙酰一肟与强酸作用，产生二乙酰。后者与尿素反应生成红色的二嗪化合物（Fearon反应），其显色程度与尿素含量成正比。与经同样处理之尿素标准液比色，即可求出血尿素含量。 H+ H+ 二乙酰一肟 H2O 羟胺 二乙酰 ＋ ＋ 二乙酰 尿素 二嗪化合物(红色) ＋

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