生物化学实验 CQMU

1. 生物化学实验 CQMU 纸层析法观察转氨基作用 P、63 生物化学与分子生物学实验室 2008.09

2. 实验目的 • 学习氨基酸纸层析的基本原理 • 掌握氨基酸纸层析的操作技术

3. 实验原理 • 层析技术 • 层析法又称色谱法，是一种根据物质的物理或化学性质不同（如吸附力、溶解度等）而建立的物质分离、分析方法，是近代生化最常用技术之一。 • 基本原理：在层析系统（固定相＋流动相）中，由于混合物各组份理化性质不同，与两相的相互作用（吸附、溶解等）能力不同，随着流动相不断向前移动，不同组分最终得以分开。

4. 纸层析 • 属于分配层析，利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中总的分配系数的不同而使物质分离的方法。 • 以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸纤维上形成固定相，有机溶剂如酚等为流动相。 • 把预分离物质加在纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，随着流动相的移动，待分离物质进行连续、动态的不断分配。在固定相分配趋势大的组份，随流动相移动的速度慢；反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组份彼此分离。

5. ALT催化的转氨基反应 • 纸层析观察转氨基作用的技术基础： 丙氨酸和谷氨酸可以通过纸层析得以分离

6. 实验步骤 • 肝匀浆制备： • 转氨基反应：取试管二支，分别标明测定管与对照管，各加入肝匀浆10滴，测定管加入37℃水浴保温10分钟，对照管放入沸水浴中煮10分钟，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1 mol/L 丙氨酸10滴，0.1 mol/L α-酮戊二酸10滴，pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液1.5 ml，摇匀，放进37℃水浴保温30分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮沸10分钟以终止反应，取出冷却后，过滤。取滤液备用。

7. 层析：准备滤纸→点样→层析→终止。 • 测定管上清液 • 0.1 mol/L丙氨酸 • 对照管上清液 • 0.1 mol/L谷氨酸

8. 显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上0.5 %茚三酮之丙酮溶液，使滤纸全部湿润再用吹风机或60℃烘箱干燥之，此时可见紫色斑出现。 • 分析：比较色斑的位置及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

9. 注意事项 • 层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛； • 操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触； • 点样点不宜过大，直径小于0.5 cm。