第六章 一般毒性作用 （ common toxicity of chemical poison ）

1. 第六章 一般毒性作用 （common toxicity of chemical poison）

2. 毒性评价或安全性评价的基本目的 • 受试物毒作用的表现和性质 • 剂量－反应（效应）研究 • 确定毒作用的靶器官 • 确定损伤的可逆性 • 其它：敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制、毒物动力学、中毒的解救措施…

3. 毒理学研究方法 动物实验 • 体内试验 • 体外试验 人群调查 • 人体观察 • 流行病学研究

4. 体内实验：以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。体内实验：以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。 • 体外实验：筛选和预测急性毒性和机制研究； • 人体实验和流行病学调查：进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料。 以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究 的基本功。

5. 动物实验 体外试验 （in vitro） 整体动物实验 （in vivo） 一般毒性试 验 特殊毒性试 验 微 生 物试 验 哺乳动物试 验 急性毒性 亚急性毒性 亚慢性毒性 慢性毒性 致突变 致癌 致畸 … 致突变 器官水平 组织水平 细胞水平 亚细胞水平 分子水平

6. 毒理学实验的基本原则 • 实验设计的统计原则 • 随机：代表性 • 对照：鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素效应大小，消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异 空白/阴/阳性对照，自身对照，历史性对照 • 重复：样本量、重复次数

7. 毒理学实验基本原则 • 动物选择 • 首先考虑代谢与毒性效应上与人一致 • 注重对受试物毒性敏感的动物物种 • 种属、品系、个体差异 • 自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得 • 动物年龄、性别

8. 根据对动物微生物控制的净化水平，实验动物分为：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物（SPF动物）、清洁动物和普通动物。根据对动物微生物控制的净化水平，实验动物分为：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物（SPF动物）、清洁动物和普通动物。 • 实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上SPF动物已成为毒理学实验的标准实验动物。

9. 剂量分组 • 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。 • 除对照组外，一般设3个或3个以上剂量组，以观察剂量一反应(效应)关系，确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。

10. 质量控制 • 优良实验室规范（GLP） • 实验操作规程 • 试剂选择 • 仪器使用 • 实验环境

12. 目的要求

13. 补充参考书 • 王心如主编.毒理学实验方法与技术.人卫 • 卡萨瑞特 道尔著.《毒理学基础》

14. 第一节 急性毒性作用 acute toxicity

15. 一、急性毒性的概念 急性毒性（acute toxicity） 机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应

16. 急性毒性的概念 • In 1984, 5,000 people died and 30,000 were permanently disabled due to exposure to methyl isocyanate（异氰酸甲酯，MIC） from an industrial accident in India • Many people die each year from inhaling carbon monoxide from faulty heaters

17. 急性毒性的概念 需要注意 • 急性接触的次数 一次:经口、注射； 呼吸道、皮肤(一段时间) 24h多次 • 中毒效应出现的时间 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要以接触毒物的时间，观察时间：7~14天 • 强度 一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡

18. 二、急性毒性试验的目的 • 求出致死剂量及其他急性毒性参数 • 观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征 • 为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据 • 为毒理学机制研究提供线索

19. 急性毒性的参数 • 半数致死剂量：LD50

20. 化合物经口急性毒性分级标准

21. 急性毒性的参数 • 剂量-反应曲线

22. 急性毒性的参数 • ED,TD：ED50, TD50,

23. 急性毒性的参数 • 急性毒作用带：Zac=LD50/Limac

24. LD50的几种计算方法 • 霍恩法（Horn）：4个剂量组 平均移动内插法（moving average interpolation） • 改进寇氏法（Karber法、平均致死量法） • Bliss法（多用于新药临床毒理学研究，计算复杂） 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法

25. 改进寇氏法 • 利用剂量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法 • 该法计算简便，准确率高，较为常用 • 要求：每组动物数相同、至少5个实验组、各剂量组组距呈等比级数、死亡率呈正态分布、最低剂量组死亡率<20%、最高剂量组死亡率>80％。

26. LD50的几种计算方法 • 霍恩法（Horn） 平均移动内插法（moving average interpolation） • 改进寇氏法 • Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法

27. 三、急性毒性试验方法的要点 总体原则 • 实验动物 • 染毒途径 • 染毒剂量 • 观察周期 • 观察指标的选择、计算方法和评价

28. （一）实验动物的选择和要求 主要原则 • 急性毒性反应与人近似 • 易于饲养、操作方便 • 繁殖力较强，数量较大 • 价格较低，易于获得 除特殊需要外，首选哺乳动物

29. 实验动物的物种和品系 • 啮齿类（rodent species） • 小鼠：昆明种、NIH、ICR • 大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar • 非啮齿类（nonrodent species） • 犬或猴 为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。

30. 实验动物的物种和品系 • 根据接触途径选择实验动物 • 急性经口和吸入毒性试验 大鼠、小鼠 • 急性经皮毒性试验 成年大鼠、豚鼠、家兔

31. 实验动物的年龄和体重 • 刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物 • 小动物根据体重 • 同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20% • 大鼠：180-240g • 小鼠：18-25g • 家兔：2-2.5kg

32. 实验动物的性别 • 雌雄各半 • 如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值 • 特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验

33. 实验动物分组与数量 • 根据组数和每组数量来决定数量 • LD50，一般为4-6组 • 大、小鼠每组10只，犬类6只 • 严格遵循随机、均衡的原则

34. 实验动物的预检 • 给药前检疫观察 • 大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2~3周 ①适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响 ②筛检健康状况不符合试验要求的动物

35. 实验动物的给药前禁食处理 • 经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供饲料 经口多次染毒可不禁食

36. （二）受试物及处理 受试物成分和配方应稳定不变 • 理化特性 • 水溶液、混悬液、油溶液 • 水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致（注射） • 水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机溶剂中 • 受试物一般应临用前新配

37. 受试物及处理 适宜容积染毒 • 毒性较大的受试物给药量较小 • 毒性较低的受试物常需较大量的染毒 • 给药容积根据染毒途径和实验动物 • 经口：20ml/kg(空腹动物) • 经皮：2ml/kg • 静脉：1ml/kg(5min以上)

38. (三) 染毒方法 • 模拟实际接触的途径和方式 • 有利于不同化学物之间结果的比较 • 受试物的性质和用途 • 受试物毒性评价程序的要求

39. 染毒方法 染毒途径 • 消化道、呼吸道、皮肤、注射 • 工业毒物：经呼吸道、皮肤 • 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 • 药品：经口、注射、皮肤 • 食品：经口 • 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤

40. 染毒方法 染毒途径影响受试物急性毒性 • 不同途径的吸收量和吸收速率 • 吸收速率：静脉注射>呼吸道>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>消化道>皮内注射>经皮 • 同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律

41. 染毒方法 经口（胃肠道）染毒 LD50值来比较不同化学物急性毒性大小 • 灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法 • 吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴 • 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入

42. 灌胃法 • 空腹 • 灌胃后2－3h复食

43. 染毒方法 灌胃法 • 灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。小鼠的灌胃针长约4～5cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约6～8cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20°左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向

44. 鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。常用灌胃量小鼠为0.2～1ml，大鼠1～4ml，豚鼠1～5ml鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。常用灌胃量小鼠为0.2～1ml，大鼠1～4ml，豚鼠1～5ml

45. 染毒方法 经呼吸道染毒 • 吸入染毒 • 静式吸入染毒 • 动式吸入染毒 • 气管内注入

46. 染毒方法 • 静式吸入染毒 • 方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物 • 染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算 • 优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠 • 缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的受试物用此法受限

47. 动物种属 呼吸通气量 (L/小时) 最低需气量 (L/小时) 不同容积染毒柜放置动物数(只) 25L 50L 100L 300L 小 鼠 大 鼠 1.45 10.18 3.45 30.5 3~5 6~10 1 12~15 1~2 36~40 5~6 实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系

48. 染毒方法 • 动式吸入染毒 将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制

49. 染毒方法 • 动式吸入染毒装置的组成 • 染毒柜 • 机械通风系统 • 配气系统

50. A 整体暴露 B 口鼻暴露 动式吸入染毒设备