Център по молекулна медицина

1. Лазерната микродисекция- безценният инструмент на молекулярната патология и диагностика, съдебната медицина и съвременната наука Център по молекулна медицина

2. Нова биомедицинска революция

3. Предизвикателството пред патологията е да интегрира клиничните, морфологичните и молекулярните измерения на заболяванията

5. От молекулярната биология до патологията и медицината: важността на тъканните биологични проби • Тъканите показват морфолигичната природа на заболяването • Откриването и характеризирането на молекулните механизми на заболяването • Валидиране на нови потенциални биомаркери • Архив • Предизвикателство: събирането на проби, етичност, процесиране (стабилност на биомолекулите), комплексност

6. .....................тъканите са комплексни

7. В близост до тумора има разнообразни клетъчни субпопулации

8. Защо тъкани? • Култивирани клетъчни линии • Предимства: самореплициращи се, дават добър добив ДНК, РНК и белтъци • Недостатъци: отнема време да се създадат, скъпо е, не винаги е успешно създаването им. Въпреки че клетъчните линии носят генетичните промени в тумора, от който произлизат, допълнителни промени възникват по време на последователните пасажи или само определени туморни клетки (например агресивни) се размножават. Генната експресия в култивираните клетки може да е много различна от тази на тумора, защото те вече не са под контрола на тъканни елементи

9. Защо тъкани? • Ксенографтно обогатяване на клетъчните култури- същите ограничения • Техники за сортиране на клетки- плътностни градиенти, флуоресцентно активирано клетъчно сортиране, антитяло-белязани имуно частички и афинитетно-белязани магнитни частички. Необходимо е обаче да се направи суспензия от клетки.

10. Развитието на микродисекцията • Микродисекция е била използвана много преди изобретяването на LM (лазерна микродисекция) • Lowry and Passonneau- използвали лиофилизирани тъканни срези • Goelz et al- използвали парафинови блокчета

11. Недостатъци на ръчните методи на микродисекция • Изисква се голяма сръчност • Въздушните течения могат да доведат до загуба на микродисектирания материал при преноса от пипета или много тънко типче в центрофужна епруветка • Риск от контаминация • Трудност в изолирането на дифузно разположени клетки • Времеемки В опит да се подобри ръчното изолиране било въведено използването на тиксо, което да покрива избраната за микродисектиране област от въздушни течения и тремор на ръката на оператора

12. Развитието на лазерната микродисекция (LM) • Meier-Ruge et al- 1976, инициират развитието на LM като използват примитивна UV лазерна технология, която заема голямо пространство, но постигат микродисекция на клетъчни субпопулации от хетерогенни тъкани по-точно от всички ръчни методи • Shibata- 1993-UV лъч, който да разрушава ДНК на нежеланите компоненти от тъканта (Selective ablation of unwanted regions) • Emmert-Buck et al- 1996 в NIH- Arcturus Engineering

13. LM разкрива нови възможности • Молекулярни анализи • Онкология/ Патология • Изследване на единични клетки • Цитогенетка • Живи клетки от клетъчни култири • Изследвания на мозъка • Криминология • Ембриология

15. LCM на определена хипоталамусна област

16. Видове LM • IR LCM- инфрачервеният лазерен пулс води до локално топене на EVA полимер, адхезиране на клетките към стопената мембрана. При охлаждане мембраната отново се втърдява и клетките се отделят от нея • UV LM-фотоизпарение на нежеланата тъкан, обграждаща желаната област чрез много тесен лазерен лъч • Комбиниращи IR и UV- Arcturus Veritas и Acturus XT

17. Принцип на IR-LCM

18. Преди LCM След LCM LCM филм

20. Апарати осъществяващи IR LCM • Arcturus/MDS, Inc • PixCell II • AutoPix

21. Arcturus PixCell II

22. Arcturus AutoPix

23. UV LM

25. UV базирани системи за LM • Laser Microdissection (LMD/Leica) • Cut and catapulting system (PALM/Zeiss) • Mmi-CellCut (MMI AG)

26. LMD/Leica

27. PALM/Zeiss

28. Mmi-CellCut (MMI AG)

29. Смесен тип LM • Съчетават UV и IR в един апарат: • Arcturus Veritas • Acturus XT

30. Arcturus Veritas Acturus XT

31. Алтернатива на лазерната микродисекция: Eppendorf PPMD microdissector По- евтин, но с по-ниска прецизност и точност

32. Характеристики на най-често използваните техники за микродисекция

34. Видове проби и изисквания към пробите • Чрез LM могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми

35. Видове проби и изисквания към пробите • Чрез LM могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми • Пробите могат да са FFPE, замразени тъкани и цитологични препарати • Факторите въздействащи на интегритета на биомолекулите са: начин и тип съхранение на пробите, времето за съхранение преди микродисекцията, метода за фиксация и метода на микродисекция

36. Очакван добив след лазерна микродисекция • 1 клетка = 6-7 pg геномна ДНК • 1 клетка = 10-30 pg тотална РНК • 80-85% rRNA • 15-20% tRNA, snRNA • 1-5% mRNA • Белтъчното съдържание зависи от типа органи и от степента на белтъчна деградация

37. Предимства на лазерната микродисекция • Бързина (особено UV LM), прецизност, гъвкавост и възможност за документиране на експериментите • Избягват се сложните стъпки, осъществявани от оператора • Не разрушава съседни тъкани • Могат да се изолират клетки разпръснати сред други клетъчни популации • Приложение в молекулната генетична диагностика • При UV системите за разлика от IR системите няма контакт с тъканта, няма риск от контаминация

38. Ограничения на лазерната микродисекция • Намалена оптична резолюция на оцветените и дехидратирани тъканни срези поради липсата на предметно стъкло • Трудности при прецизното микродисектиране на комплексни тъкани с ограничени архитектурни характеристики (лимфоидни неоплазии, дифузно инфилтрирани карциноми). • Специални багрила или имунохистохимично оцветяване • Използване на дифюзер

39. Ограничения на лазерната микродисекция • При contact-lift off метода често има затруднения в събирането на избраните клетки от препарата, което може да се дължи на здраво прикрепяне на тъканта към положително заредено предметно стъкло или на остатъчна влага останала в тъканта • При FFPE препаратите наличие на повреди в ДНК, РНК и белтъците => ограничения в PCR базираните методи за изследване- трябва да се амплифицират къси ампликони • IR LCM не са добри за дисектиране от срези по-тънки от 10µm

40. Предизвикателства пред LM • Всички микродисекционни системи са микроскоп базирани: • Оператор-зависими • Хистопатологично обучение е необходимо • Процесивност • Събирането на голям брой клетки за някои видове анализи понякога е невъзможно • Не винаги са подходящи за много малки мишени • Отделни клетки или разпръснати клетки, субклетъчна микродисекция

41. Хирургични срези Цитологични препарати Touch Prep Клетъчен блок Thin Prep Cyto Spin ИХХ оцветени Замразени В парафин FISH Смир Стабилизиране на пробите Подготовка на микроскопските препарати LM Изолиране Анализи Източници на биологичен материал

42. Приложения на LM • ДНК базирани анализи • РНК базирани анализи • Протеин базирани анализи • микроРНК базирна анализи Откриване на нови биомаркери Диагноза Прогноза Таргетна терапия

44. ДНК базирани анализи • LOH

46. ДНК базирани изследвания- LOH • LOH анализите при изследване на рак се използва за картиране на туморсупресорни гени и за изучаване честотата на промяна на определени туморсупресори при различни видове тумори • LOH за анализ на клоналността: • Анализ на клоналността на мултифокалните тумори • Клонален анализ на първичните и метастазиралите тумори • Клонален анализ на прогениторни клетки в мултикомпонентни тумори

48. ДНК базирани изследвания- клонален анализ на X свързаното алелспецифично хиперметилиране • Клетките получени от една прогениторна клетка имат инактивиране на една съща Х хромозома • За доказване на клонална неопластична трансформация

49. РНК базирани анализи • Изследване на експресионен профил • Серийни анализи на генната експресия • Микрочипове

50. Протеомика • Western Blot • 2D-PAGE • Зимограми • Обратно фазови чипове • Мас спектроскопски техники