slide1
Download
Skip this Video
Download Presentation
Център по молекулна медицина

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 81

Център по молекулна медицина - PowerPoint PPT Presentation


  • 155 Views
  • Uploaded on

Лазерната микродисекция- безценният инструмент на молекулярната патология и диагностика, съдебната медицина и съвременната наука. Център по молекулна медицина. Нова биомедицинска революция.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Център по молекулна медицина' - hadar


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Лазерната микродисекция- безценният инструмент на молекулярната патология и диагностика, съдебната медицина и съвременната наука

Център по молекулна медицина

slide3
Предизвикателството пред патологията е да интегрира клиничните, морфологичните и молекулярните измерения на заболяванията
slide5
От молекулярната биология до патологията и медицината: важността на тъканните биологични проби
  • Тъканите показват морфолигичната природа на заболяването
  • Откриването и характеризирането на молекулните механизми на заболяването
  • Валидиране на нови потенциални биомаркери
  • Архив
  • Предизвикателство: събирането на проби, етичност, процесиране (стабилност на биомолекулите), комплексност
slide8
Защо тъкани?
  • Култивирани клетъчни линии
    • Предимства: самореплициращи се, дават добър добив ДНК, РНК и белтъци
    • Недостатъци: отнема време да се създадат, скъпо е, не винаги е успешно създаването им. Въпреки че клетъчните линии носят генетичните промени в тумора, от който произлизат, допълнителни промени възникват по време на последователните пасажи или само определени туморни клетки (например агресивни) се размножават. Генната експресия в култивираните клетки може да е много различна от тази на тумора, защото те вече не са под контрола на тъканни елементи
slide9
Защо тъкани?
  • Ксенографтно обогатяване на клетъчните култури- същите ограничения
  • Техники за сортиране на клетки- плътностни градиенти, флуоресцентно активирано клетъчно сортиране, антитяло-белязани имуно частички и афинитетно-белязани магнитни частички. Необходимо е обаче да се направи суспензия от клетки.
slide10
Развитието на микродисекцията
  • Микродисекция е била използвана много преди изобретяването на LM (лазерна микродисекция)
    • Lowry and Passonneau- използвали лиофилизирани тъканни срези
    • Goelz et al- използвали парафинови блокчета
slide11
Недостатъци на ръчните методи на микродисекция
  • Изисква се голяма сръчност
  • Въздушните течения могат да доведат до загуба на микродисектирания материал при преноса от пипета или много тънко типче в центрофужна епруветка
  • Риск от контаминация
  • Трудност в изолирането на дифузно разположени клетки
  • Времеемки

В опит да се подобри ръчното изолиране било въведено използването на тиксо, което да покрива избраната за микродисектиране област от въздушни течения и тремор на ръката на оператора

slide12
Развитието на лазерната микродисекция (LM)
  • Meier-Ruge et al- 1976, инициират развитието на LM като използват примитивна UV лазерна технология, която заема голямо пространство, но постигат микродисекция на клетъчни субпопулации от хетерогенни тъкани по-точно от всички ръчни методи
  • Shibata- 1993-UV лъч, който да разрушава ДНК на нежеланите компоненти от тъканта (Selective ablation of unwanted regions)
  • Emmert-Buck et al- 1996 в NIH- Arcturus Engineering
slide13
LM разкрива нови възможности
  • Молекулярни анализи
  • Онкология/ Патология
  • Изследване на единични клетки
  • Цитогенетка
  • Живи клетки от клетъчни култири
  • Изследвания на мозъка
  • Криминология
  • Ембриология
slide16
Видове LM
  • IR LCM- инфрачервеният лазерен пулс води до локално топене на EVA полимер, адхезиране на клетките към стопената мембрана. При охлаждане мембраната отново се втърдява и клетките се отделят от нея
  • UV LM-фотоизпарение на нежеланата тъкан, обграждаща желаната област чрез много тесен лазерен лъч
  • Комбиниращи IR и UV- Arcturus Veritas и Acturus XT
slide18
Преди LCM

След LCM

LCM филм

ir lcm1
Апарати осъществяващи IR LCM
  • Arcturus/MDS, Inc
    • PixCell II
    • AutoPix
uv lm1
UV базирани системи за LM
  • Laser Microdissection (LMD/Leica)
  • Cut and catapulting system (PALM/Zeiss)
  • Mmi-CellCut (MMI AG)
slide29
Смесен тип LM
  • Съчетават UV и IR в един апарат:
    • Arcturus Veritas
    • Acturus XT
eppendorf ppmd microdissector
Алтернатива на лазерната микродисекция: Eppendorf PPMD microdissector

По- евтин, но с по-ниска прецизност и точност

slide34
Видове проби и изисквания към пробите
  • Чрез LM могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми
slide35
Видове проби и изисквания към пробите
  • Чрез LM могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми
  • Пробите могат да са FFPE, замразени тъкани и цитологични препарати
  • Факторите въздействащи на интегритета на биомолекулите са: начин и тип съхранение на пробите, времето за съхранение преди микродисекцията, метода за фиксация и метода на микродисекция
slide36
Очакван добив след лазерна микродисекция
  • 1 клетка = 6-7 pg геномна ДНК
  • 1 клетка = 10-30 pg тотална РНК
    • 80-85% rRNA
    • 15-20% tRNA, snRNA
    • 1-5% mRNA
  • Белтъчното съдържание зависи от типа органи и от степента на белтъчна деградация
slide37
Предимства на лазерната микродисекция
  • Бързина (особено UV LM), прецизност, гъвкавост и възможност за документиране на експериментите
  • Избягват се сложните стъпки, осъществявани от оператора
  • Не разрушава съседни тъкани
  • Могат да се изолират клетки разпръснати сред други клетъчни популации
  • Приложение в молекулната генетична диагностика
  • При UV системите за разлика от IR системите няма контакт с тъканта, няма риск от контаминация
slide38
Ограничения на лазерната микродисекция
  • Намалена оптична резолюция на оцветените и дехидратирани тъканни срези поради липсата на предметно стъкло
  • Трудности при прецизното микродисектиране на комплексни тъкани с ограничени архитектурни характеристики (лимфоидни неоплазии, дифузно инфилтрирани карциноми).
    • Специални багрила или имунохистохимично оцветяване
    • Използване на дифюзер
slide39
Ограничения на лазерната микродисекция
  • При contact-lift off метода често има затруднения в събирането на избраните клетки от препарата, което може да се дължи на здраво прикрепяне на тъканта към положително заредено предметно стъкло или на остатъчна влага останала в тъканта
  • При FFPE препаратите наличие на повреди в ДНК, РНК и белтъците => ограничения в PCR базираните методи за изследване- трябва да се амплифицират къси ампликони
  • IR LCM не са добри за дисектиране от срези по-тънки от 10µm
slide40
Предизвикателства пред LM
  • Всички микродисекционни системи са микроскоп базирани:
    • Оператор-зависими
    • Хистопатологично обучение е необходимо
  • Процесивност
    • Събирането на голям брой клетки за някои видове анализи понякога е невъзможно
  • Не винаги са подходящи за много малки мишени
    • Отделни клетки или разпръснати клетки, субклетъчна микродисекция
slide41
Хирургични срези

Цитологични препарати

Touch Prep

Клетъчен блок

Thin Prep

Cyto Spin

ИХХ оцветени

Замразени

В парафин

FISH

Смир

Стабилизиране на пробите

Подготовка на микроскопските препарати

LM

Изолиране

Анализи

Източници на биологичен материал

slide42
Приложения на LM
  • ДНК базирани анализи
  • РНК базирани анализи
  • Протеин базирани анализи
  • микроРНК базирна анализи

Откриване на нови биомаркери

Диагноза

Прогноза

Таргетна терапия

slide46
ДНК базирани изследвания- LOH
  • LOH анализите при изследване на рак се използва за картиране на туморсупресорни гени и за изучаване честотата на промяна на определени туморсупресори при различни видове тумори
  • LOH за анализ на клоналността:
    • Анализ на клоналността на мултифокалните тумори
    • Клонален анализ на първичните и метастазиралите тумори
    • Клонален анализ на прогениторни клетки в мултикомпонентни тумори
slide48
ДНК базирани изследвания- клонален анализ на X свързаното алелспецифично хиперметилиране
  • Клетките получени от една прогениторна клетка имат инактивиране на една съща Х хромозома
  • За доказване на клонална неопластична трансформация
slide49
РНК базирани анализи
  • Изследване на експресионен профил
  • Серийни анализи на генната експресия
  • Микрочипове
slide50
Протеомика
  • Western Blot
  • 2D-PAGE
  • Зимограми
  • Обратно фазови чипове
  • Мас спектроскопски техники
slide60
Изолиране на inner cell mass cells (белите стрелки)

Трофектодермални клетки (черни стрелки)

slide65
Простатна тъкан преди LCM

LCM туморен епител

LCM тумор асоциирана строма

Простатна тъкан преди LCM

LCM нормален епител

LCM нормална строма

slide66
Приложението на LM в криминалистиката
  • STR анализите- основен метод за ДНК базирана идентификация
    • Повечето следи съдържат клетки от повече от един източник => изолиране на ДНК от повече от един индивид -> микс от генотипи и трудно интерпретиране на резултатите
    • Често клетките на жертвата са много повече от клетките на извършителя
slide67
Трудно интерпретиращи се резултати:
    • Ниска ДНК концентрация
    • ДНК деградация
    • Присъстивие на инхибитори
  • Изход- LM
slide68
Недостатъци на разработените методи за разделяне на сперматозоиди от други клетки
  • Диференциален лизис метод- за разделяне на спермата от епителните клетки
    • Получават се две фракции (ДНК от извършителя и ДНК от жертвата), но разделянето НЕ винаги е пълно
  • У- хромозомен STR анализ
    • У хромизомите са идентични при всички роднини по бащина линия
slide69
Недостатъци на разработените методи за разделяне на сперматозоиди от други клетки
  • Филтрационен метод
    • 70% от сперматозоидите преминават през филтъра, а епителните клетки остават на повърхността
    • 1-2% от епителните клетки също успяват да преминат през филтъра
  • Флуоресцентно активарано клетъчно сортиране
    • Прилага се единствено за вагинални лаважи. НЕ може да се прилага за вагинални натривки или архивен материал, нито за разделяне в тъканни препарати
slide70
Недостатъци на разработените методи за разделяне на сперматозоиди от други клетки
  • Магнетично активирано клетъчно сортиране
    • Трудно се открива моноклонално антитяло специфично свързващо антиген на повърхността на сперматозоидите
    • Антитен стабилен в деградирали съдебни проби
  • Микро изфабрикувано устройство за разделяне на сперматозоиди от епителни клетки на Horsman et al- базира се на различни физични свойства на клетките
    • Само 25% от сперматозоидите се възстановяват (остават интактни)
slide71
Всички тези методи са неефикасни при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материал

За да се направи пълен ДНК профил са необходими 15-20 интактни сперматозоида, които могат да бъдат осигурени чрез LM.

slide72
Разработващи се методи
  • Изолиране и на други мъжки клетки- добра алтернатива при азооспермените извършители
    • Полово специфично белязане на келтки за LCM- FISH- У хромозомни специфични проби
  • Изолиране на женски клетки (от кондоми)
    • Белязана на Х и У хромозомите с различни флуоресцентни багрила
slide74
Приложенияна LM в криминалистиката
  • Събиране на фоликули от косми с цел по-ефикасно изолиране на ДНК без контаминиращи вещества (инхибитори като кератин)
  • Изолиране на кръвни клетки от различни клетъчни смеси- например от кръв и слюнка
  • LCM за получаване на ДНК профили от биологични проби, когато са смесени с отломки, замърсители, прах, мръсотия
    • Изолиране на клетки от букална лигавица смесени с почва
slide75
Приложенияна LM в криминалистиката
  • Отделяне на клетки от лепенки, използвани за събиранее на улики от коли, трупове и др.
lm expression microdissection xmd automated cell recognition
Бъдещето на LM- Expression Microdissection (xMD), Automated Cell Recognition
  • Имуно-базирана микродисекционна технология за бърза, специфична и полу-автоматична тъканна микродисекция
slide78
Не е необходима микроскопска идентификация на таргетните клетки
    • Срезите са ИХХ белязани. Препарата се покрива с термочувствителен филм, следва облъчване на цялото и поле и накрая филмът се отделя със захванатите таргетни клетки
  • Процесират се около 50 000 клетки за секунда
  • Елиминират се трудностите при селекцията на таргетни клетки поради не добрата картина
  • Оператор- независима система
ad