ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

1. ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

2. Organización del laboratorio: • Depende del tamaño • Puede ser una sección dentro del laboratorio de análisis clínicos o un servicio aparte. • Existe un facultativo/a responsable del servicio y un supervisor/a.

3. ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA • Áreas o Secciones Básicas: • Sección de toma de muestras • Sección de recepción y registro de muestras • Sección de siembra de muestras • Sección de medios de cultivo • Área de almacén • Áreas o Secciones Especializadas: • Sección de Bacteriología • Sección de micobacterias (Separada y restringido el acceso) • Sección de micología Sección de antibióticos • Sección de serología o inmunomicrobiología

4. Áreas o Secciones Básicas:Sección de toma de muestras • Para la obtención de muestras de pacientes ambulatorios • Las muestras de sangre se extraen en el área común de extracciones de los laboratorios

5. Áreas o Secciones Básicas:Sección de recepción y registro de muestras • Se registran las muestras asignándoles el número correspondiente. • Se realiza una primera evaluación, rechazando las que no cumplan los requisitos.

6. Áreas o Secciones Básicas:Sección de siembra de muestras • Procesamiento inicial y siembras en diferentes medios de cultivo • Deben disponer de esquemas claros de procesamiento rutinario de las muestras

7. Áreas o Secciones Básicas:Sección de medios de cultivo • Se fabrican los medios de cultivo y reactivos • Se realiza el lavado del material • Se esteriliza el material, medios y productos contaminados antes de desecharlos (Autoclave)

8. Áreas o Secciones Básicas:Área de almacén • Almacén de medios de cultivo • Almacén de reactivos. Debe disponer de cámara frigorífica y desecadores para los medios y productos que lo requieran.

9. Áreas o Secciones Especializadas:Sección de Bacteriología • Se interpretan los cultivos, tinciones y otras técnicas para la identificación de los microorganismos previamente aislados. • Se realizan las técnicas inmunológicas de diagnóstico rápido (detección de antígenos en las muestras).

10. Áreas o Secciones Especializadas:Bacteriología (continuación) La sección de bacteriología se subdivide en las siguientes áreas: • Urocultivos • Coprocultivos y Parásitos • Exudados y Anaerobios • Hemocultivos

11. Áreas o Secciones Especializadas:Sección de micobacterias Básicamente para el aislamiento e identificación de Mycobacterium tuberculosis Debido al alto riesgo que conlleva el trabajo con micobacterias esta sección debe estar separada de las demás y restringido el acceso a ella.

12. Áreas o Secciones Especializadas:Sección de antibióticos • Se realizan las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (antibiograma).

13. Áreas o Secciones Especializadas:Sección de serología o inmunomicrobiología • Normalmente en espacio aparte, muy automatizado. • Detección de antígenos y anticuerpos en suero y otras muestras. Otras secciones (solo en algunos laboratorios especializados): - Virología - Biología molecular

14. Niveles de seguridad biológica Cuatro niveles: Nivel 1: Laboratorios de enseñanza. Se trabaja con microorganismos no patógenos y patógenos oportunistas. Nivel 2: Laboratorios de hospitales o centros de salud de nivel primario. Se trabaja con Microorganismos y muestras de peligrosidad potencial moderada a alta. Nivel 3: Laboratorios que trabajan con microorganismos y muestras de alto riesgo. Nivel 4: Solo en laboratorios de experimentación con microorganismos (especialmente virus) de altísimo riesgo o exóticos.

15. Técnicas Básicas en Microbiología Clínica. Material específico: • Medios de cultivo • Placas petri • Tubos, pipetas Pasteur, torundas, morteros y bisturís estériles. • Asas de siembra • Campanas de Durham • Otros como porta y cubreobjetos, cubetas de tinción, mecheros, etc.

16. Técnicas Básicas en Microbiología Clínica.Aparataje en el lab. de microbiología: • Estufas de cultivo (37ºC – Bacterias patógenas). • Autoclave y horno pasteur. • Baños termostáticos. • Cabinas de seguridad. • Neveras y congeladores. • Microscopios.

17. Técnicas de pre-tratamiento de muestras • Centrifugación: Se realiza a todos los líquidos corporales que son habitualmente estériles excepto orina (sangre, LCR, pleural, etc.), sembrando el sedimento. • Homogeneización de tejidos: en morteros estériles o tubos de fondo cónico y embolo con 1 a 2 ml de caldo nutritivo • Sembrar mediante una pipeta Pasteur estéril en los medios de cultivo adecuados.

18. Preparación de extensiones para tinción • Improntas de tejidos. • Extensiones finas: Para muestras no sólidas. • Se extiende homogéneamente una pequeña gota de exudado sobre el porta. (Con asa: Frotis) • Si la muestra es demasiado espesa: Diluir con solución salina.

19. Técnicas de siembra de las muestras más comunes • ORINA: Con asa calibrada (1µl, 5 µ l, etc). Homogeneizar por agitación previamente la orina y confirmar la formación de película en el asa). Sembrar:

20. Técnicas de siembra de las muestras más comunes • Siembra de muestras a partir de torundas: • Provienen de exudados faríngeos, óticos, conjuntivales, endocervicales, uretrales, etc.). • Se aplica técnica de siembra para aislamiento por agotamiento del asa en placa.

21. Técnicas de siembra de las muestras más comunes • TEJIDOS: • Homogeneizar. • Depositar unas gotas con una pipeta Pasteur en los medios líquidos. • Técnica de aislamiento en los sólidos. • EXUDADOS: Sembrar directamente. • LÍQUIDOS CORPORALES PREVIAMENTE CENTRIFUGADOS: Sembrar el sedimento. • CATETERES INTRAVENOSOS: Hacer rotar la punta del catéter sobre una placa de agar-sangre (técnica de Maki). • ORINA: Homogeneizar invirtiendo el tubo y sembrar.

22. INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO • Recolección, transporte y conservación de las muestras. • Exámen macroscópico. • Exámen microscópico. • Cultivo y aislamiento. • Identificación bioquímica y susceptibilidad a los antimicrobianos. • Inoculación en animales de experimentación. • Pruebas serológicas complementarias.

23. Recolección, transporte y conservación de las muestras. • Tomar la muestra antes de la administración de antimicrobianos. • Tomar del sitio más probable de hallar el microorganismo infeccioso con mínima contaminación externa. • En estadío agudo de la enfermedad. • Cantidad suficiente para que permita un análisis completo. • Recoger en recipientes estériles. • Entrega de inmediato al laboratorio. • Acompañada de datos clínicos suficientes. • Se puede usar medio de transporte para conservar viabilidad de los microorganismos (Medio Stuart).

24. Exámen macroscópico • Aspecto, color, olor, pH, densidad, contenido de proteínas, etc. • Brindan información adicional de utilidad para la evaluación integral de la muestra en estudio.

25. Exámen microscópico • Se busca el agente etiológico por microscopía óptica. • Exámen en fresco: Gota de la muestra, diluída si es necesario, entre porta y cubre-objetos. • Exámen con técnicas de coloración: Extendido con cantidad reducida del material en estudio, sobre un porta-objetos y una vez seco se lo fija con calor o metanol. En base a la observación microscópica se pueden seleccionar los medios de cultivo y las técnicas a emplear para la identificación del microorganismo.

26. Tinciones • Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos: • Catiónicos: Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina. • Aniónicos:Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina. • Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: negro sudán.

27. Las tinciones pueden ser: • Simples: Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). • Diferenciales: Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen diferente composición química, y por lo tanto no reaccionan de igual forma frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. Tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas utilizan más de un colorante. • Selectivas:Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen diferente composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej: tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.

28. Ejemplo de tinción simple positiva Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñemicroorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula. Procedimiento: 1. Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra. 2. Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque. 3. Añadir Azul de metileno y esperar 2 minutos. 4. Lavar con agua. 5. Secar. 6. Observar primero con el objetivo 40×; luego se añade aceite de inmersión y se observa con el objetivo 100×.

29. Ejemplo de tinción simple negativa Nigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Procedimiento: 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire. 5. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión).

30. Ejemplo de tinción selectiva Tinción de endosporas. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridiumsecaracterizan porque forman endosporas. Estas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie en situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos tóxicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la célula bacteriana y cuando la célula muere y se lisa la endospora queda libre. Germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium [ej. C. tetani (tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. botulinum(botulismo)] y Bacillus [ej. B. anthracis (antrax)].

31. Procedimiento: Método de Wirz. 1. Extensión (B. megaterium). 2. Desecación y fijación por calor. Cubrir con papel de filtro y teñir con Verde malaquita. Pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 10 minutos. 4. Retirar el papel y lavar con agua. 5. Teñir con fucsina durante 3 minutos. 6. Lavar con agua. 7. Secar. 8. Observar (100×). Se observan las esporas verdes y las formas vegetativas rojas. Método de Moeller: Acido crómico 5%-5min. Fucsina fenicada 10 min. Alcohol ácido 20-30 seg. Azul de metileno 5 min. Esporas rojas y formas vegetativas azules.

32. Tinciones diferenciales. Tinción de Gram:De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. Fundamento: radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: • bacterias Gram+ : tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared. • bacterias Gram- : tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Luego de fijar con calor se efectúa la tinción con el primer colorante (Cristal violeta, 1 min-30 seg), se lava con agua y se cubre con Lugol 1 min. Se lava con agua y luego se decolora 30 seg conetanol-acetona que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán VIOLETAS. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (fucsina diluída, 3 min) para que puedan observarse de color ROSA.

33. Gram(-)

34. Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen): • Se basa en que ciertos microorganismos resisten la decoloración con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido. • Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimumtuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra). Las micobacterias se ven Rojas y el resto azul.

35. Procedimiento: 1. Extensión (Mycobacteriumphlei y Micrococcusluteus). 2. Desecación y fijación al calor. 3. Teñir con Fucsina fenicada con Ziehl-Neelsen y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 10 minutos. 4. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos. 5. Lavar con agua. 6. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 6 minutos. 8. Lavar con agua. 9. Secar. 10. Observar (100×).

36. Otro tipo de tinciones • MayGrunwaldGiemsa: Solución de eosina y azul de metileno disueltas en metanol. Sirve para detectar microorganismos intracelulares. Núcleos azules (acidófilos) y citoplasmas (basófilos) rosas. Bacterias azules. • Tinción de flagelos:Muy dificil de captarlos. Se forma un precipitado de nitrato de plata alrededor del flagelo y de esta manera lo engrosa. • Tinción de cápsula: Muy difícil teñirlas. Lo mejor es teñir el fondo y que el germen resalte la cápsula sin teñir. Método de Antony: cápsulas azules y microorganismo azul-violeta oscuro. Método de burri: Fondo negro, microorganismo rojo y la cápsula como un halo blanco que lo rodea.

37. Cultivo • Medios de cultivos que sirven para el desarrollo, aislamiento e identificación de los microorganismos ya que la mayoría de las bacterias patógenas pueden cultivarse artificialmente. • Medios de cultivo usados normalmente: Líquidos, semisólidos y sólidos. • Se necesitan otros factores importantes para el cultivo: la tº (35-37ºC) y la presión de oxígeno o de dióxido de carbono. • La mayor parte de las bacterias causales de infecciones humanas son: Aerobias, anaerobias facultativas y en menor grado anaerobias estrictas (jarra con sales de Bicarbonato de sodio, borhidruro de sodio, agua y catalizador paladio o Tubo tapado y calentado). • Los microorganismos pueden ser QUIMIÓTROFOS (heterótrofos: Fuente de C de comp. orgánicos o autótrofos: CO2), los que usan una fuente de energía química. FOTÓTROFOS (heterótrofos: Fuente de C de comp. orgánicos o autótrofos: CO2), los que usan una fuente de energía lumínica. QUIMIOHETERÓTROFOS: Animales, mayoría de los hongos, protozoos y bacterias (aceptor final de e-: O2) Aerobios. Aceptores no O2: Fermentadores (compuesto orgánico), Streptococcus. Anaerobios (compuestos inorgánicos), Clostridium.

38. Medios de cultivo • Fuente de energía apropiada (H de C, aunque también se usan para pruebas de identificación bioquímica ). Ojo esterilización! • Minerales. • Factores de crecimiento que son incapaces de sintetizar por sí mismos. • Factores estimulantes. • pH adecuado: 6,8-7,6 • En general son isotónicos. • Proteínas (fuente de N y a veces de C). Aa: sólo en medios para pruebas de identificación bioquímica. • Indicadores de pH (Rojo fenol). Ojo inhibidores! • Agentes gelificantes para medios sólidos (Agar). Cada bacteria tiene necesidades de crecimiento diferentes a otras y eso se aprovecha para fabricar medios de cultivo con distinta composición y así aislar determinados patógenos.

39. GENERALES:Los medios generales son medios ricos que permiten el crecimiento de la gran mayoría de los microorganismos. Se utilizan en la siembra primaria de las muestras clínicas para recuperar a casi cualquier agente patógeno. Uno de los medios generales más utilizados en el laboratorio es el agar sangre.

40. Medios químicamente definidos Al preparar el cultivo microbiano se debe tener en cuenta que hay que añadir al medio una fuente de energía así como de C, N, S, P y cualquier factor necesario para el crecimiento que el microorganismo sea incapaz de sintetizar. Un medio químicamente definido es aquel del que se conoce la composición química exacta. Los microorganismos que necesitan muchos factores de crecimiento se denominan EXIGENTES: Lactobacillus.Un medio definido químicamente mucho más sencillo es el que requiere para el crecimiento E. Coli, una bacteria menos exigente.

41. Medios complejos La mayoría de las bacterias heterotróficas y los hongos se cultivan de forma rutinaria en medios complejos cuya composición química exacta VARÍA ligeramente de un lote a otro. Éstos medios están formados por nutrientes como extracto de levadura, de carne o de vegetales, o por digeridos de proteínas de éstas u otras fuentes. Las necesidades de energía, C,N y S de los microorganismos en crecimiento están ampliamente cubiertas por las proteínas.Si este tipo de medio esta en forma líquida se denomina CALDO NUTRITIVO y cuando se le añade agar se llama AGAR NUTRITIVO.

42. Medio que representa en su composición la base mínima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de los microorganismos en estudio. Medios Mínimos

43. Medios SelectivosSe utilizan para inhibir el crecimiento de bacterias no deseadas y facilitar el de las que se buscan. Por ejemplo el agar de sulfuro de bismuto se utiliza para aislar de las heces la bacteria Gramnegativa de la fiebre tifoidea, Salmonella typhi.Los colorantes como el verde brillante inhiben selectivamente a las bacterias Grampositivas y éste colorante es la base del medio denominado agar verde brillante utilizado para el aislamiento de Salmonella. Existen dos factores importantes de cultivo selectivo para un determinado organismo: Las condiciones de cultivo deben ser FAVORABLES al organismo que se quiere enriquecer. El medio debe hacerse lo más DESFAVORABLE posible para el desarrollo de los otros organismos.

44. Medios Selectivos *Enriquecimiento: se basa en una libre competencia entre diferentes organismos en medio líquido. Si se inocula en un medio selectivo líquido una variedad de organismos y se incuba bajo determinadas condiciones aquellos microorganismos para los que el ambiente sea más favorable crecerán más que los otros y finalmente serán predominantes. Un ejemplo de este medio es el caldo de tioglicolato (aerobios estrictos, anaerobios facultativos y anaerobios estrictos). *Técnica de aislamiento directo: se emplean en medios sólidos, de esta forma se evita la competencia entre los diferentes tipos microbianos; la dispersión de los organismos sobre el medio elimina en gran parte una competencia por los nutrientes y por eso las bacterias que crecen lentamente son capaces de producir colonias en el mismo ambiente que las que crecen rápidamente. Por lo tanto, esta técnica aísla el número máximo de tipos de microorganismos que son capaces de crecer en determinadas condiciones.

45. Los medios diferenciales hacen más fácil la distinción de las colonias de los microorganismos buscados respecto de otras colonias que crecen en la misma placa. Suelen identificarse casi siempre de acuerdo a la cromogénesis. El agarMcConkey es un medio sólido que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Los primeros adoptan una coloración rosada que los diferencia de los segundos. Los medios diferenciales además pueden poner de manifiesto mezclas y contaminaciones en las placas de cultivo. Medio Diferencial

47. Clasificación de medios de cultivo según su presentación • Medios deshidratados o liofilizados: Son medios que se comercializan tal cual y una vez en el laboratorio deben ser preparados adicionando la cantidad de agua correspondiente en condiciones totalmente asépticas y se llevan a pH si es necesario. • Medios ya preparados: Elaborados por las casas comerciales presentando un determinado control de calidad y características específicas adecuadas a cada tipo de cultivo. • Medios sólidos en placa Petri:Son medios sólidos que ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas.

48. Medios sólidos en tubo: Corresponden a tubos con agar inclinado (pico de flauta) y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. Son útiles para observar el crecimiento aerobio microbiano si se ha sembrado por estría, el crecimiento anaerobio microbiano si se ha sembrado por picadura (anaerobiosis facultativa) y para la conservación de cepas. • Medios líquidos en tubo: No permiten visualizar colonias sino que sirven para realizar pruebas bioquímicas o para aumentar la concentración del microorganismos inoculado. Estos medios no contienen agar. • Medios semisólidos en tubo: Se siembran por picadura y se utilizan en ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de la movilidad, la prueba de oxidación-fermentación. • Medios de doble fase en frasco o tubo: Constituidos por una fase sólida y otra líquida. Suelen contener obturadores de caucho manteniendo completamente aislado el medio.

49. Medios de cultivo más utilizados en el laboratorio * El agar sangre y el agar chocolate son los medios más frecuentemente empleados en el laboratorio. Son medios generales en los que crecen la mayor parte de las bacterias patógenas. Constan de un medio base de nutrientes, agar y sangre de caballo o carnero que constituye un suplemento nutricional para el cultivo. La única diferencia entre ambos es que en el agar chocolate la sangre está hemolizada de modo que todos los factores nutricionales, tanto extra como intraeritrocitarios están a disposición de los microorganismos. Por eso el agar chocolate puede considerarse como de enriquecimiento en relación con el agar sangre. Haemophylusinfluenzae es un bacilo Gram negativo exigente que necesita de factores intraeritrocitarios para crecer y atmósfera rica en CO2. No crece en agar sangre y si en agar chocolate incubado en alta concentración de CO2.

50. *En los laboratorios de microbiología se utilizan también medios líquidos sobre todo de enriquecimiento. Recuperan microorganismos exigentes en sus requerimientos e inóculos bajos en las muestras clínicas. Los medios de tioglicolato y tripticasa de soja son los más comunes. * El agarMcConkey es el medio selectivo para bacilos Gramnegativos más frecuentemente utilizado . * Otros medios selectivos son el manitol salado, caldo selenito, el agarCampylosel para Campylobacter y Helicobacter, medio CIN para Yersinia, etc. Los medios de Sabouraud específicos para hongos también pueden considerarse como selectivos porque suelen inhibir el crecimiento bacteriano. *El medio de Schaedler es un medio sólido muy enriquecido que se utiliza para el cultivo de microorganismos anaerobios. *Los medios de Mueller-Hinton con y sin sangre son los estandarizados en la realización de pruebas de antibiograma.