制药微生物发酵技术

1. 制药微生物发酵技术 Pharmaceutical microbial fermentation technology —工作过程导向课程 —“教学做”一体模式 天津职业大学 生物制药专业 ENTER

2. 项目1 项目2 项目4 项目3 项目5 制药微生物发酵技术 制药微生物发酵技术----课件

3. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 1-2黄色短杆菌培养基的制备、灭菌和优化 最佳黄色短杆菌培养基的确定 2

4. 制药微生物发酵技术 告知： 1.学会一般培养基的制备原理、方法。 2.掌握培养基及器皿的灭菌方法。

5. 制药微生物发酵技术 引入（任务项目） 谷氨酸的产量，第二关键取决于菌种的生长？ 菌种的生长依靠于 ? ？

6. 制药微生物发酵技术 操练 提出培养基概念→提出流程→称量→溶解→pH→灭菌

7. 不同微生物对营养物质的要求各不相同。因此，配制培养基要根据微生物的营养特点。一般，培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基(或麦芽糖、蛋白胨培养基)。不同微生物对营养物质的要求各不相同。因此，配制培养基要根据微生物的营养特点。一般，培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基(或麦芽糖、蛋白胨培养基)。 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 培养基是根据微生物生长繁殖的营养需要，用人工方法配制而成的基质,其中含有水、碳源、氮源、无机盐及各种生长因子。培养基可为微生物的生长提供能源、组成菌体的原料，调节代谢活动。

8. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的pH范围，如细菌培养基中性偏碱，放线菌培养基偏碱，霉菌、酵母菌培养基偏酸。 训练项目1

9. 根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入1.5～2.0％的琼脂，半固体培养基加入0.3～0.5％琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入1.5～2.0％的琼脂，半固体培养基加入0.3～0.5％琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

10. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 一、材料和用具 1.材料 马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、K2HP04、MgS04·7H2O、FeS04·7H20、NaOH、HCl。 2.用具 试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pH试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、(比色盘)铁丝筐。

11. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 二 、方法 1.培养基的制作方法 (1)称量 按照培养基的配方，准确称取各成分于烧杯中。 (2)溶解、加热 向上述烧杯中加入所需要水量，搅动，然后加热使其溶解。用马铃薯、豆芽等配制的培养基，须先将马铃薯或豆芽按其配方的浓度加热煮沸0.5h (马铃薯须先削皮)并用纱布过滤，然后加入其他成分继续加热使其溶化，补足水量，如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉加热煮融，再加人其他药品，并补足水量。

12. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 (3)调节pH值 初制备好的培养基往往不能符合所要求的pH值，故需用酸度计，pH试纸或用氢离子浓度比色计来矫正，用0.1mol/L NaOH或lmol/L HCl调至合适的范围。 (4)过滤 用滤纸或双层纱布(中间夹一层脱脂棉花)趁热过滤。 (5)分装 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管或三角烧瓶内，管(瓶)口塞上棉塞(或硅胶泡沫塞)，用牛皮纸包扎管(瓶)口。

13. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 培养基的分装

14. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 ①液体培养基：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。 ②固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过1/2为宜；倒平板的培养基每管装15～20mL。 ③半固体培养基：分装试管一般以管高度1/3为宜，灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂。

15. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

16. (6)灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基0.1MPa，20-30min，含糖培养基为0.05MPa，30min。(6)灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基0.1MPa，20-30min，含糖培养基为0.05MPa，30min。 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

17. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 三、内容 （一）根据配制培养基的步骤,按下列培养基配方配制培养基。 1.肉膏蛋白培养基(W/V)(培养细菌用) 牛肉膏 0.3g 琼脂 2.0g 蛋白胨 1.0g 蒸馏水 100ML NaCl 0.5g pH 7.2-7.4

18. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 2.马铃薯(PDA)培养基(W/V)(培养霉菌用) 马铃薯 20g 蒸馏水 100mL 蔗糖 2.0g pH 自然 琼脂 2.0g 马铃薯汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重量，切成小块,加水煮沸30min,纱布过滤，补足水量。

19. 3.高氏1号(W/V)(培养放线菌用) 可溶性淀粉 2.0g FeSO4 0.001g K2HP04 0.05g 琼脂 2.0g MgS04·7H20 0.05g 蒸馏水 100mL KNO3 0.1g pH 7.6-7.8 NaCl 0.05g 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，补足水量，0.1MPa压力，灭菌20min.

20. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 （二）培养基制作注意事项 训练项目1 1.加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。 2.pH值必须按各种不同培养基的要求准确测定。 3.所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。保证容器外壁无水。

21. 4.分装培养塞时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染。4.分装培养塞时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染。 5.培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌后，必须放在37ºC温箱培育24h．无菌生长方可使用。 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

22. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 （三）棉塞制作 训练项目1 棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管(或三角烧瓶)完全适合。过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管(或三角烧瓶)中，达不到过滤杂菌的目的。棉塞过小往往易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1/3在外，2/3在试管内。

23. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

24. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 目前，有条件的实验室已使用.塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。

25. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 （四）灭菌 训练项目1 1.培养基的高压蒸汽灭菌 ①需灭菌的物品(分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基)，棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好(防止锅内水汽把棉塞淋湿)，放人灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。

26. ②将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。②将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。 ③打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5～10min，关闭放气阀。 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

27. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 ④关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121ºC，压力达0.1MPa时，保持20～30min，即达到灭菌目的。 ⑤灭菌完毕，待压力自然降至“0”时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。 ⑥打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

28. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 2.干热灭菌法 常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干热法灭菌。进行灭菌时，先将要灭菌器皿(培养皿、吸管的包装方法见示范)包好，放入电热烘箱内，调节温度至160～170ºC，维持1～2h(当温度升至80ºC以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂和火灾)。灭菌后，当温度降至30～40ºC时，打开箱门，取出灭菌器皿。

29. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 （五）实验步骤 训练项目1 1.按教师指定的小组，每一小组制一种培养基300mL，其中200ml分装于2～3个锥形瓶中，另外l00mL分装入试管每管5～7mL，灭菌后制成斜面。 2.每一小组制备无菌水1瓶(100mL三角烧瓶中加水99mL，内装少许玻璃珠)，制备无菌水试管4支(每支试管加水9mL)灭菌。 3.每一小组准备lmL塑料吸嘴5支(湿热蒸汽灭菌)，培养皿12套(干热灭菌）。

30. 黄色短杆菌培养基的制备与灭菌 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 四、报告 写出你所制备的培养基的配方，并分析其中所含物质对微生物生命活动所起的作用。

31. 制药微生物发酵技术 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用比浊法（直接比色法）进行测定。用分光光度计测定菌液的OD值，OD值以0.2～0.6为宜(OD值过高，加大稀释倍数；过低，降低稀释倍数)。 正交试验是一种最常用的发酵条件优化方法，它可以较少的试验次数得到准确的结果，从而节约大量的人力物力。

32. 制药微生物发酵技术 ⒈ 菌种 黄色短杆菌 ⒉ 材料 葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl ⒊ 用具 恒温摇床、分光光度计、SBA-40C多功能葡萄糖-谷氨酸分析仪、天平、电炉、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、硫酸纸、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀

33. 制药微生物发酵技术 ⒈ 培养基的配制 表正交表试验设计/g•100 mL-1

34. 制药微生物发酵技术

35. 制药微生物发酵技术 ⒉ 将上述培养基配制好以后，每个250 mL三角瓶中装入培养基25 mL，每个配方作3瓶，实训结果取平均值。全部于121 ℃下灭菌20 min，冷却备用。 ⒊ 接入黄色短杆菌菌悬液，接种量为5％，置于37 ℃恒温摇床进行培养，转数100 rpm。 ⒋ 将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的发酵液摇均匀后于620 nm波长、1 cm比色皿中测定OD值。比色测定时，以未接种的培养基作空白对照，并将OD值填入表中，最终确定最佳培养基的组成配比及发酵时间。

36. ⒈ 掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基的确定方法。 ⒉ 了解对已确定菌种的发酵条件进行优化的方法。 最佳黄色短杆菌培养基的确定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2

37. 制药微生物发酵技术 归纳总结 • 微生物所需要的营养； • 工业上常用成分； • 优化培养基的方法。

38. 制药微生物发酵技术 应知应会 培养基（medium）优化（optizium）

39. 制药微生物发酵技术 问题与讨论 ⒈ 比浊法在生产实践中有何应用价值? ⒉ 本实训为什么采用620 nm波长测定黄色短杆菌菌悬液的光密度？如果你在实训中需要测定酵母生长的OD值，你将如何选择波长?

40. 制药微生物发酵技术 作业: 优化配方的报告

41. 谢谢！ 谢谢各位专家！ 恳请指导

42. 恳请各位专家指导！ 谢谢！