第三节氧化磷酸化

第三节氧化磷酸化 一、概念二、氧化磷酸化偶联部位及P/O比三、氧化磷酸化机理四、氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂五、线粒体穿梭系统六、氧化磷酸化的调控

一、概念 • 生物体内高能磷酸化合物ATP的生成主要由三种方式： • 氧化磷酸化 • 底物水平磷酸化 • 光合磷酸化

底物水平磷酸化指ATP的形成直接与一个代谢中间物（PEP）上的磷酸基团转移相偶联的作用。底物水平磷酸化指ATP的形成直接与一个代谢中间物（PEP）上的磷酸基团转移相偶联的作用。 1、底物水平磷酸化特点：ATP的形成直接与中间代谢物进行的反应相偶联；在有 O2或无O2条件下均可发生底物水平的磷酸化。

2、氧化磷酸化 • 是与电子传递过程偶联的磷酸化过程。即伴随电子从底物到O2的传递，ADP被磷酸化生成ATP的酶促过程，这种氧化与磷酸化相偶联的作用称为氧化磷酸化。 • 这是需氧生物合成ATP的主要途径。 • 真核生物的电子传递和氧化磷酸化均在线粒体内膜上进行。原核生物则在质膜上进行。

二、氧化磷酸化偶联部位及P/O比 • 1、P/O比： • 1940年，S Ochoa测定了在呼吸链中O2的消耗与ATP生成的关系，为此提出P/O比的概念。（同位素实验） • 当一对电子经呼吸链传给O2的过程中所产生的ATP分子数。实质是伴随ADP磷酸化所消耗的无机磷酸的分子数与消耗分子氧的氧原子数之比,称为P/O比。 • 线粒体NADH+H+经呼吸链氧化P/O比为2.5（3），FADH2经呼吸链氧化P/O比为1.5（2）。

2、形成ATP的部位（氧化与磷酸化偶联部位） • 电子传递链将NADH和FADH2上的电子传递给氧的过程中释放自由能，供给ATP的合成。其中释放大量自由能的部位有3处，即复合物Ⅰ(将NADH上的电子传递给CoQ的过程)、Ⅲ（将电子由CoQ 传递给细胞色素c的过程）、Ⅳ（将电子从细胞色素c传递给氧的过程），这3个部位就是ATP合成的部位，称为偶联部位。 • ATP的合成是由线粒体内膜上的ATP合酶（复合体Ⅴ，H+-ATP酶）催化的。

能量计算：NADH+H+被分子氧氧化生成水，总反应为：NADH+H++1/2O2能量计算：NADH+H+被分子氧氧化生成水，总反应为：NADH+H++1/2O2 ΔG0 ’ =-nF ΔE0 ’ NAD++H2O 求此反应的ΔG0 ’ ：因为：1/2O2+2H++2e- H2O , E0 ’ =0.82v NAD++2H++2e- NADH+H+, E0 ’ =-0.32v 所以： ΔE0’=0.82-(-0.32)=1.14V ΔG0 ’=-223.063  1.14=-52.7(Kcal/mol) =-220.5(KJ/mol) 3ADP+Pi 3ATP+3H2O ΔG0 ’=3 7.3=21.9 (Kcal/mol)=91.6 (KJ/mol) 3个ATP的形成共截获的能量为42%

三、氧化磷酸化作用的机理 1、有关氧化磷酸化机理的几种假说化学偶联假说构象偶联假说化学渗透假说

线粒体的结构 外膜——平滑，含约50%脂类和50%蛋白，蛋白质中有些可以形成孔道蛋白，能通过分子量小于4000~5000的物质。内膜——含约20%脂类和80%蛋白。它是细胞质和线粒体基质之间的主要屏障。内膜有许多向内的折叠，称为嵴。嵴与嵴之间形成区室。内膜上有许多球状颗粒（内膜球体），内膜还含有许多富含蛋白质的跨膜颗粒（如电子传递链颗粒、跨膜运送颗粒等）。

（1）化学偶联假说（1953年） chemical coupling hypothesis 认为电子传递反应释放的能量通过一系列连续的化学反应形成高能共价中间物，它们随后裂解驱动氧化磷酸化，即将其能量转移到ADP中形成ATP。

（2）构象偶联假说（1964） conformational coupling hypothesis 认为电子沿电子传递链传递使线粒体内膜的蛋白质组分发生了构象变化，形成一种高能构象，这种高能形式通过ATP的合成而恢复其原来的构象。迄今未能分离出这种高能蛋白质。但在电子传递过程中蛋白质组分的构象变化还是存在的。

（3）化学渗透假说（1961） chemiosmotic hypothesis • 1961年由英国生物化学家Peter Mitchell最先提出。 • 认为电子传递释放的自由能和ATP的合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的。即电子传递释放的自由能驱动H+从线粒体基质跨过内膜进入膜间隙，从而形成跨线粒体内膜的H+离子梯度，及一个电位梯度。这个跨膜的电化学电势驱动ATP的合成。

化学渗透假说示意图 内膜和外膜间隙线粒体内膜获得1978年的诺贝尔化学奖线粒体基质 • NADH呼吸链中的三个复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起着质子泵的作用，将H+从线粒体基质跨过内膜进入膜间隙。 • H+不断从内膜内侧泵至内膜外侧，而又不能自由返回内膜内侧，从而在内膜两侧建立起质子浓度梯度和电位梯度即电化学梯度，也称为质子动力。 • 当存在足够的跨膜电化学梯度时，强大的质子流通过嵌在线粒体内膜的F0F1-ATP合酶返回基质，质子电化学梯度蕴藏的自由能释放，推动ATP的合成。

支持化学渗透假说的实验证据： • 氧化磷酸化作用的进行需要封闭的线粒体内膜存在。 • 线粒体内膜对H+ OH- K+ Cl-都是不通透的。 • 破坏H+浓度梯度的形成（用解偶联剂或离子载体抑制剂）必然破坏氧化磷酸化作用的进行。 • 线粒体的电子传递所形成的电子流能够将H+从线粒体内膜逐出到线粒体膜间隙。 • 大量直接或间接的实验证明膜表面能够滞留大量质子，并且在一定条件下质子能够沿膜表面迅速转移。 • 迄今未能在电子传递过程中分离出一个与ATP形成有关的高能中间化合物，亦未能分离出电子传递体的高能存在形式。 H+如何通过电子传递链“泵”出的？

关于H+通过电子传递链“泵”出的两种假设（一般了解）关于H+通过电子传递链“泵”出的两种假设（一般了解） • 氧化-还原回路机制 ( Mitchell提出）：线粒体内膜呼吸链的各个氧-还中心即FMN CoQ CytC以及Fe-S中心的排列可能即执行电子转移又能转移基质的质子。但是在电子传递链中，（H +e-）载体只有两个即FMN CoQ，则三个ATP合成部位中还缺少一个（H +e-）载体，假设CoQ发挥两次作用。（Q循环） • 质子泵机制：电子传递导致复合体的构象变化，而造成AA侧链pK 的变化，发挥质子泵作用的侧链暴露在内膜内侧或外侧（交替变化），从而使质子发生移位。合成一个ATP，大约需要2-3个跨膜质子。

ATP的合成机制—FOF1-ATP合酶 • 线粒体内膜的表面有一层规则地间隔排列着的球状颗粒，称为FOF1-ATP合酶，也叫ATP合酶复合体或ATP合酶，是ATP合成的场所。它由FO、F1两部分组成，FO起质子通道作用，F1催化ATP的合成。 • FO由4种6条不同的肽链组成，是跨线粒体内膜的疏水蛋白质，它是质子通道。F1由5种9条肽链组成，呈球状，是复合体的头，与FO结合后这个头伸向膜内基质。 • FO是膜外质子返回膜内的通道，F1是催化ATP合成的部位，当膜外的质子经FO质子通道到达F1时便推动ATP的合成。

F1部分包括9个亚基，3个亚基、3个亚基及、、亚基个1个。 亚基是催化ATP合成的部位， 亚基连接FO和F1。 FO上有离子通道和6个二环己基二亚胺（DCCD，DCC，DCCI）结合蛋白，这些蛋白围成桶状，具有离子通道，通道内部有谷氨酸残基（大肠杆菌是天冬氨酸残基），这些残基可与DCCD结合，从而抑制质子通过FO 。连接F1部分和FO部分是一个短柄，包含有两种蛋白质，寡霉素敏感性付与蛋白（OSCP）和偶合因子6（F6），寡霉素可与FO结合，抑制质子通过FO。

根据当前最新测定, H+经NADH-Q还原酶、细胞色素bc1复合体（ Ⅲ ）、细胞色素氧化酶（复合体Ⅳ）从基质泵到膜外时，一对电子泵出的质子数依次为4、2、4，而合成一个ATP分子是由2-3个H+通过ATP合酶所驱动。所以电子从NADH传至O2，共产生的ATP分子数是2.5个 • 若从琥珀酸传递至O2，只有两个偶联部位，产生1.5个ATP。 Fe-S FADH2 琥珀酸-Q还原酶（复合体Ⅱ ）

四、氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂 不同的化学因素对氧化磷酸化作用的影响方式不同，据此将它们分成三大类： 1、特殊试剂的解偶联作用某些化合物能消除跨膜的质子浓度梯度或电位梯度，使ATP不能合成，这种作用称为解偶联作用，这类化合物成为解偶联剂。 • 解偶联剂不抑制电子传递。不抑制底物水平的磷酸化。 • 解偶联剂主要有三种类型： • 化学解偶联剂：2、4-二硝基苯酚 • 离子载体抑制剂： • 氧化磷酸化抑制剂：

化学解偶联剂：2、4-二硝基苯酚 （2、4-dinitrophenol,DNP） • DNP在pH=7的环境中以解离形式存在，是脂不溶的，不能过膜。 • 在酸性环境中接受H+,成为不解离形式，是脂溶性的，很容易过膜，同时将H+带入膜内，起消除质子浓度梯度的作用。亦称质子载体。 • 起同样作用的有三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（FCCP）。中性环境酸性环境

离子载体（离子载体抑制剂） • 是一类脂溶性物质，能与H+以外的其他一价阳离子结合，并作为他们的载体使他们能过穿过膜，消除跨膜的电位梯度。 • 缬氨霉素（K+） • 短杆菌肽（K+ Na+）

氧化磷酸化抑制剂 • 直接作用于ATP合酶复合体而抑制ATP合成的一类化合物。由于它干扰了由电子传递的高能状态形成ATP的过程，从而间接抑制电子传递和降低O2的利用率。（区别于电子传递链抑制剂） • 寡霉素、双环己基碳二亚胺（抑制FOF1某些蛋白的活性） • 寡霉素等对利用氧的抑制作用可被DNP解除。

线粒体呼吸的5种状态（B.Chance and G R Williams） 悬浮的线粒体实验：状态I：无底物和ADP；状态II：只有ADP 状态III：有底物和ADP 状态IV：有底物和再加入的ADP 状态V：氧被耗尽时，线粒体呼吸停止。

寡霉素对氧消耗的抑制以及DNP解除寡霉素的抑制作用：寡霉素对氧消耗的抑制以及DNP解除寡霉素的抑制作用：

解偶联蛋白（产热素） • 是存在于某些生物细胞线粒体内膜上的蛋白质，为天然解偶联剂。 • 它们能形成质子通道，让膜外的H+通过通道返回膜内，消除跨膜质子浓度梯度。如：动物的褐色脂肪组织，其产热机制是线粒体氧化磷酸化解偶联的结果。人、新生无毛的哺乳动物以及冬眠的哺乳动物。

五、线粒体穿梭系统（细胞质内NADH的再氧化）五、线粒体穿梭系统（细胞质内NADH的再氧化） • 真核细胞细胞质中产生的NADH必须进入线粒体才能经呼吸链氧化并生成ATP.但NADH不能直接透过线粒体内膜。需通过两个穿梭途径进入。 • 磷酸甘油穿梭 • 苹果酸-天冬氨酸穿梭（肝﹑ 心中）

1、磷酸甘油穿梭（P/O=2或1.5） 外膜膜间空间胞液内膜 NAD+ P-甘油 P-甘油 FAD 3-P甘油脱氢酶（胞液） FP1 3-P甘油脱氢酶（内膜） Fe-S FADH2 CoQ P-二羟丙酮 NADH+H+ P-二羟丙酮 cytb 昆虫飞行肌细胞溶胶NADH利用此穿梭

2、苹果酸-天冬氨酸穿梭（P/O=3或2.5） 动物心脏及肝脏胞质溶胶内NADH 利用此穿梭膜间空间外膜内膜基质胞液苹果酸 NAD+ NAD+ 苹果酸 Ⅰ 2 1 1 草酰乙酸草酰乙酸 NADH+H+ NADH+H+ α-酮戊二酸 α-酮戊二酸 3 4 谷氨酸谷氨酸 Ⅱ 天冬氨酸天冬氨酸 1、胞液的苹果酸脱氢酶 2、线粒体基质的苹果酸脱氢酶 3、胞液的天冬氨酸转氨酶 4、线粒体基质的天冬氨酸转氨酶 Ⅰ、苹果酸-α酮戊二酸反向交换载体Ⅱ天冬氨酸-谷氨酸反向交换载体

苹果酸穿梭系统

NADH脱氢酶（复合物Ⅰ） 内膜内侧，朝向基质催化线粒体内部的NADH脱氢交给其辅基FMN 将氢传递给CoQ 外NADH脱氢酶内膜外侧，朝向膜间空间是一种以FAD为辅基的黄素蛋白，催化细胞液的NADH脱氢交给其辅基FAD 将氢传递给CoQ，不经过复合物Ⅰ，P/O比为2或1.5 3、外NADH脱氢酶（真菌和高等植物）

真菌和高等植物的胞液NADH进入呼吸链氧化的途径真菌和高等植物的胞液NADH进入呼吸链氧化的途径 FAD FMN 外膜膜间空间基质胞液内膜 NADH+H+ NADH+H+ NADH+H+ FPint FPext Fe-S NAD+ CoQ NAD+ NAD+ cytb （P/O=2或1.5）

葡萄糖彻底氧化的能量计算： • 原核生物 • 真核生物：不同组织 • EMP的能量计算也需考虑部位。

六、氧化磷酸化的调控 • ADP是关键物质。 • ADP作为关键物质对于氧化磷酸化作用的调节称为呼吸控制（respiratory control）当细胞利用ATP做功时，ADP含量上升，又促进氧化磷酸化作用合成ATP。呼吸控制的定量表示法是测定ADP存在时O2的利用率（III）与没有ADP时O2的利用率（IV）之比值。完整MT（mitochondrion）的呼吸控制值可达10，而受损伤或衰老的MT其呼吸控制值可降为1。

电子显微镜观察表明： • 状态III时，MT的超微结构为“紧缩态”，ATP生成系统处于“活动”状态。 • 状态IV时，MT的超微结构为“常态”，ATP生成系统处于“静止”状态。紧缩态常态

第三节 氧化磷酸化