Autoimunitní onemocnění

1. Autoimunitní onemocnění

2. Autoimunitní onemocnění • Wittebského kriteria • Je charakterizován autoantigen a poškozujicí reakci lze reprodukovat in vitro nebo in vivo (přenosem faktorů séra nebo buněk na experimentální zvíře

3. Autoimunitní reakce • humorální typ - tvorba autoprotilátek s následným cytotoxickým účinkem nebo ukládáním IK (II. A III. typ imunopatologické reakce • Buněčný typ – působení Tc a Th1 lymfocyty, cytokinovými působky a aktivací makrofágů (IV. typ reakce)

4. Tolerance • Mechanismy udržující imunitní reakci vůči vlastním tkáním ve fyziologických mezích • Prolomení autotolerance = vznik autoimunity • Centrální a periferní tolerance • Thymus a kostní dřeň • Pozitivní selekce – thymus – jsou zachovány T ly rozpoznávající vlastní • Negativní selekce – eliminace lymfocytů , které rozeznávají komplexy MHC-vlastní peptid s příliš vysokou afinitou • Kostní dřeň – negativní selekce B ly

5. Příčiny vzniku autoimunity • Multifaktoriální • Vnitřní genetické ( 25-70% výskyt u jednovaječných dvojčat) • Zevní • Výskyt onemocnění u jednovaječných dvojčat a experimentální modely

6. Vnitřní faktory • Asociace s MHC – asociace s určitým haplotypem – HLA-B 27 • Geny kodující cytokiny • Geny řídící a regulující apoptózu • Asociace s imunodeficity • Polymorfismus genů kodujících TCR a H řetězce Ig • Humorální faktory

7. Vnější faktory • Infekce, stres, léky, UV záření • Infekce odkryje nedostupné autoantige ny(kryptické antigeny) • Zánětlivé cytokiny způsobí ektopickou expresi MHC molekul II. Třídy a napomáhají prezentaci peptidů , které jsou jinak nepřístupné • Exprese kostimulačních molekul • Molekulární mimikry • Mikrobiální superantigeny – polyklonální aktivace T ly včetně autoreaktivních, stejně tak B lymfocytů

8. Rozdělení autoimunitních onemocnění • Systémová a orgánově specifická • Incidence autoimunitních onemocnění – 5% • Systémová – reakce proti konzervovaným strukturám jaderných a orgánově nespecifických antigenů

9. Systémová autoimunitní onemocnění • SLE ( ANA, anti-ds DNA) • RA (Fc částem Ig – RF) • Dermatopolymyositida ( ENA – Jo-1, PM-Scl) • Sjogrenova choroba ( ENA-SS-A, SS-B) • Systémová sklerodermie (Scl 70) • Smíšená choroba pojiva (U1-RNP) • Antifosfolipidový sy (ACLA) • Vaskulitidy (ANCA) • Sarkoidóza

10. Orgánově lokalizovaná autoimunitní onemocnění • Ulcerozní kolitida (ANCA) • Crohnova choroba (Saccharomyces cerevisae – nejde o autoprotilátky) • Celiakie (antigeny endomysia – tkánová transglutamináza • Autoimunitní hepatitidy (autoantigeny –enzymy CYP 450, SLA-solubile liver antigen, LKM-1 anti liver kidney microsomes • PBC (mitochondriální autoantigeny) • Plicní fibróza (ANCA, proti cytokeratinům)

11. Orgánově specifická autoimunitní onemocnění • Autoimunitní endokrinopatie – Hashimotova tyreoiditida, Graves-Basedova choroba (tyreotoxikosa), juvenilní DM, Addisonova choroba (proti kůře nedledvin), atrofická gastritida a perniciozní anémie, autoimunitní poruchy reprodukce, autoimunitní polyglandulární sy • Autoimunitní neurologická onemocnění – Myasthenia gravis (Ab proti Ach receptoru), periferní demyelinizační neuropatie, RS • Autoimunitní cytopenie

12. Imunofluorescence • Reakce antigen – protilátka • Přímá a nepřímá • Přímá - specifická protilátka označená fluoresceinem • Nepřímá - k řezu tkáně nebo suspenze se přidá vyšetřovaný vzorek , následně specifická protilátka se vizualizuje druhou protilátkou konjugovanou vhodným fluorochromem • Diagnostika autoprotilátek • Substráty – tkáňové řezy, buněčné suspenze, fixovaná tkáňová kultura • Protilátky – primární protilátka je přítomna v séru, sekundární protilátka ( králičí, kozí, myší) proti lidské Fc části imunoglobulinové molekuly

13. Imunofluorescence – orgánově nespecifické • Hep 2 – (buněčná lidie lidského nazofaryngeálního karcinomu • ANA , cílová struktura – jádro • Typy fluorescence – homogenní - anti-dsDNA, periferní a zrnitá – ENA • Critidium lucilliae – prvok s kinetoplastem, kinetoplast • Lidské neutrofilní leukocyty – ANCA – cytoplazma, granula neutrofilů c- ANCA (cytoplazmatický typ, proteináza 3), pANCA (periferní typ, myeloperoxidáza) a A-ANCA (atypická fluorescence)

14. Orgánově nespecifické autoprotilátky • Opičí jícen – antiendomysiální protilátky (EMA) cílový antigen – tkáňová transglutamináza • Krysí ledviny – AMA antimitochondriální, ledvinné tubuly , dehydrogenázy 2-oxo kyselin • Krysí žaludek – pariet. bb(GPCA) cílový antigen – K+/H+ATPáza a vnitřní faktor, hladký sval (ASMA) • Opičí ledviny – bazální membrána glomerulů (anti GBM), antigen – kolagen IV • Krysí játra a ledviny – autoprotilátky proti mikrosomům (LKM), hepatocyty a tubulární buňky ledviny, cílový antigen – cytochrom P450

15. Fluorescence • Fluorochromy – fluoresceinizothiokyanát (FITC), ve světle o vlnové délce 490 nm emituje zelené světlo 517 nm • Tetrametylrhodamin – červené světlo (absorbce 550 nm, excitace 580 nm) • Subjektivní hodnocení, autofluorescence • Přístrojové vybavení – fluorescenční mikroskop s dopadajícím světlem • manipulace s protilátkami – rozmrazení a zmrazení, sluneční světlo

16. Imunohistochemické metody • Vizualizace konkrétní molekuly v buňkách a tkáních • Princip vazby antigenu a protilátky – polyklonální, monoklonální • Přímá a nepřímá • Příprava buněk a tkání , parafín, zmrazené tkáně • Světelná nebo elektronoptická mikroskopie • Fixace (paraformaldehyd, aceton, metanol)) nebo permeabilizace buněčné membrány (Triton X-100) • Vyšetření buněčných suspenzí – příprava pomocí cytocentrifugy (cytospin) – BAL, likvor

17. Imunohistochemie • Imunohistochemická reakce – nespecifická (hydrofobní nebo iontová interakce), proto blokace • Hovězí albumin nebo neimunní imunoglobuliny(ředěné sérum zvířete) • Ředění • Značení protilátek – alkalická fosfatáza nebo peroxidáza • Metoda vícenásobného značení – protilátky od různých zvířecích druhů – myší a králičí/kozí, protilátka druhého kroku je značená fluorescenčně • Subjektivní hodnocení – preparát vs. Pozadí • Úskalí metody – ko vzorky , blokující peptid od výrobce – syntetický peptid použitý k imunizaci a získání protilátky –smíchání vzorku protilátky s blokujícím peptidem dojde k vyvázání Fab fragmentu ¨protilátky a reakce by měla být negativní

18. Imunohistochemie • Využití • Složení buněčného infitrátu u autoimunitních chorob, detekce imunokomplexů a složek komplementu v tkáních, typizace lymfomů • Vybavení – mikroskop , mikrotom, lednice -80C, pH metr • Cave!!! Opakované rozmrazení a zmrazení • Zvýšení dostupnosti antigenního epitopu – opracování v mikrovlnné troubě nebo enzymatickým natrávením komerčně dostupnými systémy