MUTAZIONE

1. MUTAZIONE Cambiamento della struttura del genoma che causa una variazione del genotipo attraverso le generazioni Base molecolare della variabilità

2. Comparsa improvvisa di un caso di acondroplasia da genitori sani Condizione autosomica dominante Gene coinvolto "recettore del fattore di crescita dei fibroblasti di tipo 3", (FGFR3). Questo recettore, in condizioni normali esplica un controllo di tipo negativo sulle cellule della cartilagine di accrescimento. Mutazioni di FGFR3 lo rendono costitutivamente attivato (mutazioni con “guadagno di funzione”) FGFR3 mutato è in grado di segnalare continuamente alla cellula un segnale negativo, col risultato di inibire l’allungamento dell’osso.

3. ACONDROPLASIA 1138 G A 1138 G C Gly (380)Arg D. transmembranoso CROUZON Ala(391)Glu D. transmembranario TD Arg(258)Cys IgII-IgIII interloop TD Lys(650)Met TK2 IPOCONDROPLASIA Lys(540)Leu 70% TK1 S - S S - S S - S FGFR3

4. Mutazione in un gene Gene normale Prodotto genico normale Espressione fenotipica normale Trascrizione e traduzione Evento mutazionale Prodotto genico parzialmente funzionante/non funzionante/assente Espressione fenotipica alterata Gene mutato N.B. NON TUTTE LE MUTAZIONI CAUSANO UN’ALTERAZIONE DELLE PROTEINE E NON TUTTE LE MUTAZIONI AVVENGONO NELLA REGIONE CODIFICANTE DEL GENE

5. mutazioni …..EFFETTO MINIMO O NULLO (non alterazioni della proteina) POLIMORFISMI se la frequenza è superiore all’1% LETALE  proteina anomala FENOTIPO ANOMALO

6. Classificazione in base ……….. …….. alla tipologia e all’estensione Mutazioni cromosomiche: sono alterazioni di numero o di struttura dei cromosomi Mutazioni geniche: interessano i geni TIPO MECCANISMO FREQUENZA ESEMPIO Genomiche Errori di segregazione 10-2/div. cell. Aneuploidia N° cromosomi CromosomicheErrori di ricombinazione 6X10-4/div. cell. Duplicazioni Struttura cromosomi Delezioni Geniche Errori della duplicazione 10-10/bp/div. cell. Mut. puntiformi Poche basi 10-5-6/ locus/gen.

7. Mutazioni spontanee: Duplicazione. 3 miliardi di coppie di basi devono essere replicate ad ogni divisione cellulare, in un periodo di 2-3 ore. Velocità di circa 100.000 bp/sec. Avvengono casualmente degli errori Ricombinazione. Processo fondamentale per generare “diversità biologica”, a causa della struttura di particolari regioni genomiche, è un’altra fonte di possibili errori. Segregazione. Processo finale della mitosi e della meiosi. Avvengono casualmente degli errori che portano ad una errata ripartizione dei cromosomi nelle cellule figlie.

8. COSA CAUSA LE MUTAZIONI? Classificazione in base …… …….. all’origine Mutazioni spontanee: insorgono in assenza di agenti mutageni esterni e sono prodotte da fenomeni di ricombinazione (crossing-over) o replicazione del DNA Mutazioni indotte: dovute all’azione sul DNA di agenti chimici, fisici o biologici

9. La differenza principale tra mutazioni spontanee ed indotte è la frequenza di mutazione Numero di eventi mutazionali mutazionali (cellule o individui) Totale della popolazione Le mutazioni indotte hanno una frequenza di mutazione superiore a quella che si osserva per le mutazioni spontanee

11. MUTAZIONI PUNTIFORMI Molti fattori fisici e chimici, endogeni ed esogeni, tendono se permanenti ad alterare il DNA genomico. Spesso le lesioni prodotte da: • rottura di una catena • creazione di legami covalenti tra basi contigue o complementari • escissione di una o più basi • errore di replicazione sono riconosciute e riparate dai sistemi enzimatici deputati a riparare il DNA. Se ciò non avviene l’alterazione che si verifica su una catena può essere fissata al momento della replicazione: si tratta allora di una mutazione puntiforme che si tramanderà nelle generazioni cellulari successive.

12. Mutazioni indotte: fattori esogeni (mutageni chimici, ionizzanti e irradiazione UV, calore) Calore Radiazioni UV Il calore provoca idrolisi dei legami b-N-glicosidici, creando un sito senza base. Lo zucchero-fosfato rimanenti vengono facilmente persi lasciando così un “buco”. Il risultato è generalmente una delezione.

13. Le mutazioni non sono distribuite casualmente ed uniformemente nel genoma. L’incidenza delle mutazioni nei diversi loci dipende da diversi fattori: - dimensione del locus considerato - capacità codificante o meno - caratteristiche di sequenza. ZONE CALDE DI VARIABILITA’ (HOT SPOTS MUTAZIONALI)

14. Grandezza dei geni

15. Frequenza di mutazione di alcuni geni Gene Nuove mutazioni per 106 gameti Emofilia B 2 – 3 Aniridia 2 – 5 Retinoblastoma 5 – 12 Acondroplasia 6 – 40 Emofilia A 32 – 57 Distrofia muscolare di Duchenne 43 – 105 Neurofibromatosi 44 – 100 Polycystic kidney disease 60 – 120 La frequenza di mutazione (mutazione / gene / divisione cellulare) può variare da 10-4 a 10-7 a seconda della grandezza del gene e del fatto che vi siano “hot spots” mutazionali (la frequenza in molti loci è compresatra 10-5 e 10-6).

19. MUTAZIONI PUNTIFORMI Cause più frequenti di malattie genetiche (circa il 70%). Possono essere causate da: • alterazioni biochimiche e soprattutto da deaminazione di citosine metilate localizzate in siti particolari che contengono doppiette CG (punti caldi di mutazione: HOT SPOTS) • errori di replicazione o di riparazione del DNA (delezione o addizione di un numero molto piccolo di basi). Incidenti di replicazione si producono soprattutto a livello di sequenze corte ripetute.

20. NH2 3HC 3HC N O O O N TRASFORMAZIONE DELLA CITOSINA IN TIMINA NH2 O N NH metilazione deaminazione N N TIMINA CITOSINA 5’-METILCITOSINA

21. BASI MOLECOLARI DELLE MUTAZIONI SPONTANEE ………… APPAIAMENTO ERRATO Errori che intervengono nei meccanismi di replicazione e di riparazione del DNA

22. BASI MOLECOLARI DELLE MUTAZIONI SPONTANEE Il fenomeno dello slittamento della forca replicativa è spesso la causa di brevi inserzioni/delezioni Replicazione normale Corte sequenze ripetute in tandem Slittamento indietro In questo caso si possono verificare inserzioni/delezioni per appaiamento errato causato da scivolamento di un filamento Slittamento avanti

23. Classificazione in base ……… …….. alla sede Mutazioni germinali Si verificano nei gameti e possono essere trasmesse alla prole.Danno origine ad un individuo mutato sia nelle cellule somatiche sia nei gameti Mutazioni somatiche Sono presenti esclusivamente nelle cellule dell’organismo (cellule somatiche) e non nei gameti, pertanto non possono essere trasmesse alla discendenza. Le caratteristiche mutate si manifestano solo nell’individuo in cui e’ avvenuta la mutazione e non vengono trasmesse alle generazioni successive.

25. TIPO DI MUTAZIONE(può interessare uno o pochi nucleotidi oppure centinaia di milioni di nucleotidi):DelezioniInserzioniDuplicazioniInversioni SostituzioniTransizionipurina <--> purina pirimidina <--> pirimidinaTrasversioni purina<-->pirimidina

26. TRANSIZIONI Una purina (A o G) e’ sostituita con un’altra purina (G o A) o una pirimidina (C o T) con l’altra pirimidina (T o C) TRANSIZIONE ATTTCGCCGAATTGC ATTTCGCCGGATTGC TAAAGCGGCTTAACG TAAAGCGGCCTAACG

27. TRANSVERSIONI Una purina (A o G) e’ sostituita con una pirimidina (C o T) e viceversa ATTTCGCCGAATTGC ATTTCGCCGCATTGC TRANSVERSIONE TAAAGCGGCTTAACG TAAAGCGGCGTAACG

28. MUTAZIONI ….. EFFETTO Silente nessun cambiamento nell’aminoacido codificato Missenso conservativa = residuo aa stessa classe non-conservativa = residuo aa classe diversa Nonsense terminazione prematura della proteina Frameshift cambiamenti nel frame di lettura della sequenza

29. Molte mutazioni non hanno conseguenze a livello di proteina

30. Molte mutazioni non hanno conseguenze a livello di proteina

31. AMINOACIDI Amminoacidi neutri con catene non polari Amminoacidi neutri con catene polari Amminoacidi acidi con catene polari Amminoacidi basici con catene polari

32. Amminoacido neutro con catene polari Amminoacido neutro con catene polari Amminoacido neutro con catene non polari

34. CODICE GENETICO

35. MUTAZIONI SILENTI

36. MUTAZIONI NELLE REGIONI CODIFICANTIMUTAZIONI NONSENSO Risultano da una sostituzione nucleotidica che comporta la formazione di un codone di stop (UAA, UAG o UGA). EFFETTI ….. determinano l’interruzione della traduzione, e la proteina finale, che è troncata, non è generalmente espressa.

37. MUTAZIONI NELLE REGIONICODIFICANTIMUTAZIONI MISSENSOmodificano il significato di un codone. Risulta un cambiamento di un aminoacido nella proteina corrispondente. L’impatto finale è variabile a seconda della natura del cambiamento e della sua localizzazione sulla catena polipeptidica. La mutazione può avere effetto sulla funzione e/o sulla stabilità della proteina; al contrario può non avere alcuna influenza.

38. D167H (ASPARTATO 167 ISTIDINA) ASPARTATO ISTIDINA aa neutro con catene polari aa neutro con catene non polari

39. MUTAZIONI NELLE REGIONI CODIFICANTI MUTAZIONI MISSENSOmodificano il significato di un codone. Se la mutazione si verifica a carico di uno dei 3 codoni di stop (UAA, UAG, UGA) può determinare un proseguimento della traduzione fino al codone di stop successivo. Ne risulta un allungamento della catena polipeptidica.

40. MUTAZIONI CHE CAMBIANO LA FASE DI LETTURAMUTAZIONI FRAMESHIFT • Qualunque inserzione o delezione (in un esone) di un numero di basi che non sia multiplo di 3 comporta la modifica della fase di lettura. • Determina la comparsa di un codone di stop prematuro.

41. FRAMESHIFT Delezione di un aa Cambiamento della fase di lettura del codice

42. GT AG GT AG SPLICING mRNA MUTAZIONI CHE ALTERANO LO SPLICING sito donatore di splicing sito accettore di splicing La mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing …….. il processo di eliminazione degli introni non può avvenire correttamente

43. GT AG GT AG SPLICING mRNA sito donatore di splicing sito accettore di splicing Mutazioni nei siti canonici GTe AG localizzati all’inizio e alla fine dell’introne. Mutazioni nelle sequenze consenso importanti per il riconoscimentodei limiti dell’introne da parte dei fattori di splicing Sostituzione di una base in una sequenza intronica o esonica che presenti un certo grado di omologia con sequenze consenso dello splicing (SITI CRIPTICI DI SPLICING)

44. SA SA SD SD GT CG GT AG MUTAZIONI CHE MODIFICANO SEGNALI IMPORTANTI PER I SITI DI SPLICING OMISSIONE DI UN ESONE

45. SA SA SD SD GT AG CT AG MUTAZIONI CHE MODIFICANO SEGNALI IMPORTANTI PER I SITI DI SPLICING RITENZIONE DI UN INTRONE SA SA SD SD GT CG GT AG

46. MUTAZIONI CHE MODIFICANO SEGNALI IMPORTANTI PER I SITI DI SPLICING ATTIVAZIONE DI UN SITO CRIPTICO DI SPLICING Attivazione di un sito criptico accettore di splicing nell’introne 1 ccgg SA SA SD SD SA GT AG GT AG ccag

47. MUTAZIONI CHE MODIFICANO SEGNALI IMPORTANTI PER I SITI DI SPLICING ATTIVAZIONE DI UN SITO CRIPTICO DI SPLICING Attivazione di un sito criptico donatore di splicing nell’esone 2 ccgg SD SA SA SD SD GT AG ccgt GT AG

49. NF2 EXON 4 46561 agaaaattat taacaggctg ctctggcagc cctcattaga acgccgtgag gccatctgtt 46621 gtgatcagcc tacacacctc acttcccctc acagagtatc atgtctccct tgttgctcct 46681 ttcagGTAAAGAAGCAGATT TTAGATGAAA AGATCTACTG CCCTCCTGAG GCTTCTGTGC 46741 TCCTGGCTTC TTACGCCGTCCAGGCCAAGg taggctcaaa gaagaaaaat gtatttttcc 46801 tgggcgttaa tttgggtcat gggatcactc ctatcttctc tttctttggg ttttctgtac 46861 ttcagagaga cttgccccag aaagtgagat gttatgggac ttgtggactt gaagaaccac

50. NF2 EXON 4 46561 agaaaattat taacaggctg ctctggcagc cctcattaga acgccgtgag gccatctgtt 46621 gtgatcagcc tacacacctc acttcccctc acagagtatc atgtctccct tgttgctcct 46681 ttcagGTAAAGAAGCAGATT TTAGATGAAA AGATCTACTG CCCTCCTGAG GCTTCTGTGC 46741 TCCTGGCTTC TTACGCCGTCCAGGCCAAGg taggctcaaa gaagaaaaat gtatttttcc 46801 tgggcgttaa tttgggtcat gggatcactc ctatcttctc tttctttggg ttttctgtac 46861 ttcagagaga cttgccccag aaagtgagat gttatgggac ttgtggactt gaagaaccac