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Lez 11. Regolazione post-trascrizionale Alternative splicing Regolazione di RNA terminazione RNA editing Trasposto nucleare localizzazione mRNA Fosforilazione di Initiation factors IRES Stabilità di mRNA Nonsense-mediated mRNA decay IRE/IRPs RNA silencing.

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Presentation Transcript
lez 11

Lez 11

Regolazione post-trascrizionale

Alternative splicing

Regolazione di RNA terminazione

RNA editing

Trasposto nucleare

localizzazione mRNA

Fosforilazione di Initiation factors

IRES

Stabilità di mRNA

Nonsense-mediated mRNA decay

IRE/IRPs

RNA silencing

quattro tipi di splicing alternativi
Quattro tipi di splicing alternativi

Modelli per due splicing alternativi

determinazione del sesso in drosofila
Determinazione del sesso in drosofila

È determinato dal rapporto cromosoma X/autosoma (0.5 nei maschi, 1 nelle femmine)

La cascata di regolatori determina il sesso

Sxl: sex lethal

Tra: transformer

Dsx: doublesex

sex in drosophila by alternative splicing
Sex in Drosophila by alternative splicing

Male Sxl e tra non sono funzionali. Dsx ha splice alternativo

Female: sxl si autoregola a regola tra. Tra e tra2 regolano dsx.

terminazione del rna regolazione ig
Terminazione del RNA: Regolazione Ig
  • La forma lunga, di membrana, non legge un terminatore debole. Quella corta, secretoria legge lo stop. Aumento di CStF (cleavage stimulation factor F)
editing di rna nei mammiferi da a a i
Editing di RNA nei mammiferi da A a I
  • ADAR: Adenosine Deaminase Acting on RNA
  • Inosina si appaia a C.
  • In un canale del calcio la mutazione determina GlnArg.
hiv genoma e regolazione dell export nucleare
HIV genoma e regolazione dell’export nucleare

Genoma di HIV integrato.

RRE: Rev Responsive . Element

Nella fase tardiva Rev si accumula e trasporta Unspliced RNA nel citosol

meccanismi di localizzazione del mrna
Meccanismi di localizzazione del mRNA
  • Gli mRNA possono essere diretti in zone cellulari prima della traduzione
  • Il segnale è su 3’ untranslated region (3’UTR)
3 utr nella compartimentalizzazione del rna
3’UTR nella compartimentalizzazione del RNA
  • mRNA di Hairy protein (drosofila) con 3’UTR (rosso) senza 3’UTR (verde) iniettati nell’embrione polinucleato (nuclei blue).
fosforilazione di initiation factor
Fosforilazione di initiation factor
  • eIF-2 è attivo se legato a GTP. eIF-2B cede GTP a eIF-2.
  • eIF-2 fosforilato lega avidamente eIF-2B e lo sequestra

La fosforilazione

Diminuisce la sintesi

delle proteine

internal ribosome entry site ires
Internal Ribosome Entry Site (IRES)
  • Sistema alternativo per la iniziazione della traduzione senza capping
  • IRES prendono strutture che legano alcuni fattori di iniziazione
meccanismi di degradazione di mrna
Meccanismi di degradazione di mRNA
  • La espressione genica può essere controllata dalla stabilità di mRNA (min a ore)
  • Accorciamento della coda polyA
  • Attività di endonucleasi
competizione tra traduzione e degradazione di mrna
Competizione tra traduzione e degradazione di mRNA
  • Il meccanismo di polyA shortening compete direttamente con la traduzione
  • Nella 3’UTR ci sono sequenze che modificano la velocità di accorciamento
nonsense mediated mrna decay
Nonsense-mediated mRNA decay
  • Meccanismo di controllo del mRNA
  • Se un codone di terminazione è prima della giunzione esone-introne, il mRNA è riconosciuto e degradato
iron responsive element ire
IRON RESPONSIVE ELEMENT (IRE)

Le sequenze di RNA degli Iron Responsive elements (IRE) formano tipiche strutture a stem-loop. Esse si trovano nei 5’ e nei 3’ non tradotti di mRNA che codificano per proteine del metabolismo del ferro, es. ferritine transferrin receptor

mrna structure
mRNA Structure
  • Coding region
  • Untranslated regions
    • 5’ UTR
      • 7methyl-G cap
        • Bound by cap binding proteins
      • Translation regulation
    • 3’ UTR
      • Stability elements
      • Subcellular localization (zip codes)
      • poly(A) tail
timeline for rnai discoveries
Timeline for RNAi Discoveries

Nature Biotechnology21, 1441 - 1446 (2003)

mirna details
miRNA Details
  • Originate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA)
  • Hairpin precursor ~70 nt (pre-miRNA)
  • Mature miRNA ~22 nt (miRNA)
  • First discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard (lin-4)
  • Let-7 discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at Harvard (Ruvkun lab)
another view
Another View

Microprocessor Complex

summary of players
Summary of Players
  • Drosha and Pasha are part of the “Microprocessor” protein complex (~600-650kDa)
  • Drosha and Dicer are RNase III enzymes
  • Pasha is a dsRNA binding protein
  • Exportin 5 is a member of the karyopherin nucleocytoplasmic transport factors that requires Ran and GTP
  • Argonautes are RNase H enzymes
what are the functions of mirna
What are the functions of miRNA?
  • Involved in the post-transcriptional regulation of gene expression
  • Important in development
  • Metabolic regulation (miR-375 & insulin secretion)
  • Multiple genomic loci (different expression patterns?)
mirna registry
miRNA Registry
  • Latest release contains 2909 predicted and verified miRNAs
  • 321 predicted and 223 experimentally verified in Homo sapiens
  • Mouse and human are highly conserved
  • Human is not conserved with plants
sirna
siRNA
  • Cellular response to foreign RNA
  • New tool for researchers
    • Can knock down gene expression
    • Transient or stable expression
    • Several different methods of expression
    • Several different methods of delivery
sirna design
siRNA Design
  • Initial use of longer dsRNA lead to a non-specific Type I interferon response (widespread changes in protein expressionapoptosis)
  • Dr. Thomas Tuschl’s lab discovered that RNAi is mediated by 21 and 22 nt RNAs
  • Also discovered the important characteristics needed by the RNAs
sirna expression
siRNA Expression
  • For transient expression: duplex RNA can be delivered to the cell
  • For a stable expression: a vector containing the DNA to produce a hairpin RNA
  • The vector may be plasmid, retrovirus, adenovirus
sirna delivery
siRNA Delivery
  • For cell culture
    • Lipid-based transfection
    • Electroporation
  • In vivo
    • Lipid-based
    • Conjugations
      • Bacterial phage RNA
      • Cholesterol
      • Atelocollagen
    • Viral systems (ie retrovirus & adenovirus)
applications for sirna
Applications for siRNA
  • Basic research
    • Determining protein function
    • Easier than a knockout and may be used for partial knockdowns
  • Clinical research
    • You name it
    • Cancer, hypercholesterolemia, infections, developmental defects
rna interference rnai
RNA interference (RNAi)

Iniziato da double strand RNA (dsRNA)

RISC: RNA induced silencing complex