1 / 18

Sekvenování DNA

Sekvenování DNA. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU Brno. Sekvenování DNA. Pojmem sekvenování DNA rozumíme proces určení pořadí jednotlivých bází v molekule DNA. Sekvenujeme oligonukleotidy DNA (kolem 500 bp, 1000 bp horní hranice). Sekvenování DNA. Metody sekvenování jsou založeny na:

gittel
Download Presentation

Sekvenování DNA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Sekvenování DNA MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU Brno

  2. Sekvenování DNA • Pojmem sekvenování DNA rozumíme proces určení pořadí jednotlivých bází v molekule DNA. • Sekvenujeme oligonukleotidy DNA (kolem 500 bp, 1000 bp horní hranice)

  3. Sekvenování DNA • Metody sekvenování jsou založeny na: • specifickém štěpení DNA (Maxam-Gilbert) • stop – syntéze (Sanger) • postupné syntéze (pyrosequencing) • ligaci sond (sequencing-by-ligation, SOLiD™)

  4. Základní princip 1. 2. • Produkce značených oligonukleotidů zakončených specifickou bází • Separace oligonukleotidů pomocí elektroforézy (desky, kapilára) • Detekce fragmentů (autoradiografie, fluorescence)

  5. 1. Maxam-Gilbert • Podobně jako Sangerova metoda produkuje směs značených oligonukleotidů různé délky, ovšem pomocí specifického štěpení sekvenované DNA • Svého času rozšířená metoda i přes četné nevýhody (nebezpečné chemikálie, pracný postup)

  6. 2. Sangerova metoda • Využívá DNA polymerázy a tzv. „stop nukleotidů“ • Při syntéze DNA podle templátu, který představuje sekvenovanou DNA, získáváme směs oligonukleotidů různé délky, které končí specifickou bází • Stále nejpoužívanější postup

  7. Možnosti značení

  8. Dideoxynukleotidy 2,3- dideoxy • Při Sangerově metodě používáme dideoxynukleotidy, na které už se nemůže navázat další deoxynukleotid a syntéza řetězce DNA je ukončena. • Pracujeme se 4 paralelními reakcemi. Každá reakční směs se liší přídavkem jednoho ddNTP • ddNTP se přidává v malém množství k dNTP, aby vznikaly náhodně produkty různé délky 2- deoxy

  9. Uděláme-li 4 reakce se zastavováním v pozicích čtyř různých nukleotidů a naneseme výsledky reakcí paralelně do čtyř drah gelu, můžeme číst úplnou sekvenci od 3’-konce primeru: směr pohybu produktů v gelu A T C G C T A A C T G A C C T G C A C …

  10. Fluorescenční značení Čtyři terminační nu-kleotidy jsou zna-čeny každý jiným fluorescenčním barvivem  reakce může probíhat v jedné zkumavce, pruhy v gelu se po ozáření excitačním zářením zobrazují v různých barvách podle typu nukleotidu v místě terminace

  11. emise jedné ze 4 vlnových délek podle typu fluorescenčního barviva, kterým je označen právě procházející nukleotid excitace molekuly se třídí podle velikosti Využití kapilární elektroforézy pro sekvenování kapilára naplněná polyakrylamidovým gelem zkumavka s fluo-rescenčně znače-nými produkty sekvenování

  12. Kapilární elektroforéza - detail http://www.appliedbiosystems.com/lib/multimedia/3100/212k/DSWMEDIA/3100.cfm

  13. Pyrosekvenování • Sekvenování v průběhu syntézy komplementárního vlákna • Postupně se přidáváni nukleotid trifosfáty a sleduje se, který nukleotid se naváže.

  14. PPi ATP Enzyme cascade system

  15. light time Detection of the light

  16. SOLiD systém

More Related