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抗 体

抗 体. 第四节 淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生. n ( 抗原表位 ) ↑↓ n(T/B 细胞克隆 ) ← n(TCR/BCR) ← n(V 基因 ) 机体存在着特异性识别各种抗原的 T 、 B 细胞克隆，称 T 、 B 细胞库 , 即 TCR 、 BCR 的多样性. 一个机体每一个淋巴细胞是不是具有这么巨大数量的 V 基因库呢？ 没有。 研究证明：

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Presentation Transcript

  1. 抗 体

  2. 第四节 淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生 n(抗原表位) ↑↓ n(T/B细胞克隆) ← n(TCR/BCR) ← n(V基因) 机体存在着特异性识别各种抗原的T、B细胞克隆，称T、B细胞库, 即TCR、BCR的多样性

  3. 一个机体每一个淋巴细胞是不是具有这么巨大数量的V基因库呢？ 没有。 研究证明： 不同的V基因实际上是由少数原先分隔的胚系基因片段，在淋巴细胞发生分化过程中，通过重排(组合、拼接及高频突变等)的过程，从而获得了特异性的V基因，产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同的抗原，BCR的多样性可达1014，TCR的多样性可达1016。

  4. 一、BCR、TCR基因结构及其重排 （一）胚系基因结构： • 肽链编码基因： 编码V区的基因， V区基因的下游是： 编码C区的基因 • 重链V区基因由基因片段：V、D、J拼接 • 轻链V区基因由V、J基因片段拼接 • 互补决定区CDR1+CDR2←V基因片段，大部CDR3←D，其余CDR3←J 。

  5. 14号染色体 C区的基因在V区基因的下游，1~9个，如H的C基因有9个功能性基因。 BCR/Ig的重链V区基因 是由三种胚系基因片段：V、D、J拼接而成，轻链V区基因 是由V、J两个基因片段拼接成的。互补决定区CDR1+CDR2←V基因片段，大部CDR3←D，其余CDR3←J 。 2号染色体 22号染色体 BACK

  6. C区的基因在V区基因的下游，1~9个，如H的C基因有9个功能性基因。C区的基因在V区基因的下游，1~9个，如H的C基因有9个功能性基因。 • TCR的β、δ链是由三种胚系基因片段：V、D、J 拼接而成，α、γ链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。 • V、D、J片段各有多个 一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成抗原受体V区的编码基因

  7. 14号染色体中 7号染色体q TCR的β、δ链是由三种胚系基因片段：V、D、J 拼接而成，α、γ链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。 7号染色体p BACK

  8. 二、基因重排： 1、重组酶：重组激活酶、末端脱氧核酸转移酶、DNA外切酶、DNA合成酶等。 2、等位排斥和同种型排斥 (1)等位排斥： 在一对同源染色体的某一基因座位上，二条染色体的等位基因中只有一个基因能表达。保证了一个B细胞或T细胞只能表达一种特异性的抗原受体。

  9. (2)同种型排斥： 表达同一类型肽链的不同基因座位之间的排斥。如表达L链的κ链基因在第2号染色体上，而λ链基因在第22号染色体上，在一个细胞内它们不能同时表达，只能表达其中之一，κ/λ，κ：λ=65：35。

  10. 3、类别转换(同种型转换) 在抗体应答过程中，B细胞激活后分泌Ig的类别发生转换。 类别转换主要与同一V区基因与不同重链C区基因重排有关。

  11. 表达CH的基因片段有9个，除了Cδ以外，它们之前都有一个DNA序列重复排列的转换区，如要转换某一类别，其上游的C基因片段即被环出。表达CH的基因片段有9个，除了Cδ以外，它们之前都有一个DNA序列重复排列的转换区，如要转换某一类别，其上游的C基因片段即被环出。

  12. 4、BCR(膜型Ig)和分泌型Ig 在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)，不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌出去。 如继续转录至MC(膜性外显子)，则可表达疏水性的跨膜区和膜内区，插入细胞膜，作为膜受体。

  13. 在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)，不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌出去。如继续转录至MC(膜性外显子)，则可表达疏水性的跨膜区和膜内区，插入细胞膜，作为膜受体。在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)，不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌出去。如继续转录至MC(膜性外显子)，则可表达疏水性的跨膜区和膜内区，插入细胞膜，作为膜受体。

  14. 二、多样性产生的机制 1、组合造成的多样性

  15. 2、连接造成的多样性 CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接处，可丢失或加入数个核苷酸(N插入)，在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，不需模板，直接加入核苷酸至DNA断端，在V-D-J之间，形成VNDNJ ，而显著增加了CDR3的多样性

  16. 3、体细胞高频突变造成的多样性 外周淋巴组织生发中心内的成熟B细胞，在受到抗原剌激后，已重排好的V区基因(尤CDR3)突变频率增高，称体细胞高频突变，主要为点突变，非随机性。抗原对多株高频突变细胞的选择结果，使其表达的的IgV区CDR(互补决定区)与抗原表位的互补性更优于原先分子，即为抗体的亲和力成熟。

  17. 三、淋巴细胞的克隆选择 克隆选择学说：Burnet(澳) 1957年 ①免疫细胞随机形成多样性的细胞系(克 隆,Clone),每一克隆细胞表达同一种特异的识别抗原受体，识别相同抗原。 ②胚胎期的免疫细胞系接触抗原后，该细胞系被排除或失去活性，处于抑制状态，成为禁忌克隆，产生耐受。 ③成熟淋巴细胞可识别外来抗原，被选择而活化、产生效应。

  18. 第五节抗体的功能 一、 V区的功能 —识别并特异性结合抗原 单体(IgG, IgE)— 2价 二聚体(分泌型IgA) — 4价 五聚体(IgM)— 10价（5价） 中和效应 —中和毒素和病毒 与Ag结合 —促吞噬细胞吞噬 1.抗体的结合价 2.实际意义

  19. 二、 C区的功能 1.激活补体系统 Ab(IgM、IgG) + Ag → C1q→补体经典途径 IgG4、IgA的凝聚物 →补体旁路途径 2.介导免疫细胞活性 (1)调理作用(opsonization)：IgG + 抗原(颗粒性) → FcγR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞） → 促吞噬细胞吞噬； (2)ADCC：IgG + 抗原(靶细胞) → Fc γR（NK细胞）→杀伤靶细胞； (3)介导超敏反应：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应。 3.穿越胎盘和粘膜

  20. 第六节 各类免疫球蛋白的特性和功能 一、IgG 1.一般特性 (1)单体分子； (2)四个亚类； (3)血清中含量最高(75%Ig)； (4)半衰期最长(21～23天)； (5)3～5岁达成人水平(8.0～17 mg/ml)； (6)可与SPA结合。

  21. 2.生物学活性 (1)通过胎盘（新生儿抗感染）； (2)激活补体（裂解细胞）； (3)调理作用（促进吞噬）； (4)介导ADCC（细胞毒作用）。 3.实际意义 (1)抗感染； (2)自身抗体 → 自身免疫病； (3)介导变态反应(Ⅱ、Ⅲ型)； (4)封闭抗体 → 肿瘤细胞逃逸； (5)亲合层析法 —IgG纯化； (6)免疫学检测。

  22. 二、IgM 1.五聚体，分子量最大(900 kd)，又称巨球蛋白； 2.人类发育过程中最早合成的Ig； 3.体液免疫应答最先产生的 Ig—感染早期免疫； 4.占血清Ig含量的5～10%； 5.半衰期 5天 —血清中特异性IgM水平增高提示 有近期感染； 6.激活补体； 7.IgM不能通过胎盘 →脐带血或新生儿血清中IgM 水平升高表明胎儿有宫内感染； 8.B细胞膜IgM(mIgM) →体液免疫应答； 9.自身抗体 → 自身免疫病

  23. 血清型： IgA1，单体； 分泌型：IgA2，二聚体, 粘膜局部浆细胞合成； 分泌片由粘膜上皮细胞合成； 三、IgA 1.两种类型 2.半衰期 6天； 3.占血清Ig含量的5～15%； 4.粘膜局部抗感染免疫； 5.聚合IgA激活补体替代途径。

  24. Y Y Y Y Y Y Origin of Secretory Component of sIgA

  25. 四、IgD 1.单体分子 2.存在形式 分泌型 —血清中，功能不清； 膜结合型 —B细胞表面, 3.意义 （1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体； 4.占血清Ig含量的1%； 5.半衰期 3天。

  26. 五、IgE 1.单体分子； 2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)； 3.半衰期 3天； 4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生； 5.介导Ⅰ型超敏反应； 6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异 性IgE水平增高。

  27. 第七节 单克隆抗体和基因工程抗体 一、多克隆抗体(polyclonal antibody) 1.定义 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。 2.实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病 （2）临床诊断

  28. 二、单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb) 1.定义由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 2.特点 具有高度均一性。 3.杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞 —无限增殖； 免疫B细胞 —合成、分泌特异性抗体。 4.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧 啶核苷(T)。

  29. 杂交瘤技术的理论基础 • 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 • 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 • 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb

  30. 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。

  31. 细胞DNA合成途经 1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）

  32. HAT选择培养基的原理 • HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)

  33. 抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出HGPRT-株PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）

  34. 融合的结果及命运 未融合的骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾-脾杂交细胞 未融合的脾细胞 骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞

  35. 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定

  36. 制备单克隆抗体的基本技术 1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化

  37. 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 • 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行） • 选用6-12周龄Balb/c小鼠　

  38. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 • 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 • 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

  39. 骨髓瘤细胞系选择要点： • 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 • 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 • 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） • 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％ • 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 • 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 • 饲养细胞一般在融合前一天制备

  40. 免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。 • 融合比例： • 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 • 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） • 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液

  41. 克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。 • 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 • 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法 • 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染

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