分子生物学实验 中南民族大学生命科学学院 实验教学中心 2006 年 3 月

1. 分子生物学实验 中南民族大学生命科学学院 实验教学中心 2006年3月

2. 实验一 植物基因组DNA的提取 实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶 电泳检测 实验三 植物总RNA的提取 实验四 蛋白质印迹

3. 一. 实验目的及背景 实验一 植物基因组DNA的提取 • 高等动物，高等植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对，水稻基因组有１．４×１０９个碱基对。真核细胞基因组中，约１万－１．５万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。

4. 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。

5. 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

6. 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液:CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5MEDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

7. 五、实验步骤 1. DNA的提取 （1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管， 剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时， 将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

8. （8）10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜， 转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动 30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿 将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及 80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使 沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

9. （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体， 再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min； （13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液 体，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自 然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲 液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解； （15）置于-20℃保存、备用。

10. 2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测， 1 2 3 4 5 HindIII 总DNA

11. 六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

12. 七、问 题 1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA 2．提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？

13. 实验二 PCR实验技术 一．实验目的及背景 • 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

14. ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步： • ①变性（denaturation）； • ②退火（annealing）； • ③延伸（ex tension），反应过程见下图。

16. 二、PCR反应及步骤 • 模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：

17. １．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。 • ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 • ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 • ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。 • ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。

18. ６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 • ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板 • 和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决 定因素。 • ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应 温度。

19. １０×buffer: 500mM KCl • 100mM Tris-HCl (pH9.0) • 0.1% 明胶 • 1% TritonX-100 • MgCl2 2.5mM • ４×dNTP: 1mM • 引物：TGGCCGAGCTG 5.0uM • 模板： 20ng/μl • Taq酶： 5u/μl • PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统

20. １．向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液： • 反应物 体积 • 10×buffer 2.5μl • 4×dNTP(1mM) 2.5μl • MgCl2 (25mM) 2.5μl • 无菌水 10.5μl • Taq酶 (1U/ul) 1μl • 引物 2μl • 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl • 总体积 25μl

21. 2．反应体系混匀，离心 • 3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 • 94℃变性 １分钟 • 36℃退火 １分钟 • 72℃延伸 ２分钟 • 经过40个循环 • 4．72℃延伸反应7分钟。 • 5．取20μl反应液加4μl Loading buffer在 • 6. 1.5％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 • 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结

22. 三、PCR电泳检测

23. １．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增 • 产物分子量。 • 四、问题与讨论： • １．简述ＰＣＲ基本原理 • ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意 • 哪些问题。

24. 实验三 RNA提取 一、实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法。 二、实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

25. 三、仪器、药品与试剂配方 (一)仪器 1． 低温离心机 2． 分光光度计 3． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之 后再用DEPC水浸泡冲洗。 4． 高压灭菌锅 5． 研钵、剪刀、一次性手套等

26. 实验四 蛋白质印迹技术（Western blotting） 一、目的和内容 目的：掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握蛋白质印迹技 术的基本原理和方法。 内容：本实验采用鸡卵清白蛋白为材料，对此蛋白质进行SDS— PAGE电泳后，用电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素薄 膜上，将预先制备好的鸡蛋清免疫而成的抗血清，作为 初级抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔为第二抗体， 在底物存在下，通过显色电泳条带，测定蛋白质性质。

27. 二、主要仪器、材料和试剂 1、仪器和材料 蛋白质电泳槽，蛋白质电转移槽一套（六一仪器厂），硝酸纤维素滤膜（黄岩化工厂），直径为20cm 及10cm 玻璃平皿各一个，剪刀、镊子、刀片、一次性手套，普通滤纸，鸡卵清白蛋白，鸡卵清免疫兔的抗血清，辣根过氧化酶-羊抗兔抗体（1：500 稀释），四氯奈酚或者二氨基联苯胺，过氧化氢。

28. 2、试剂 （1）TBS 要Tris-HCl NaCl 缓冲液：20mml/L Tris-HCl， 500mmol/LNaCl，PH：7.5。 （2）TBS 要Tris-HCl NaCl，Tween-20 缓冲液：20mmol/L Tris- HCl，500mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，PH：7.5。 （3）抗体溶液：牛血清白蛋白质-TBS 溶液，1%BSA-TBS。 （4）Blocking 溶液（封闭液）：10%牛血清-TBS。 （5）底物溶液（0.5mg/mL）：25mg 四氯奈酚，加5mL 甲醇溶解 后，加10ml 在30℃水浴中温浴的TBS 溶液，混合后再加 50mlTBS，然后再加入10μl 30%过氧化氢立即使用。 （6）转移缓冲液：25mmol/L Tris，192 mmol/L Glycine 20%MethnolL，pH8.3. （7）去离子双蒸水。

29. 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍 4. 醋酸钠(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 琼脂糖 11. 异丙醇

30. (三) 试剂配方 1. 0.1% DEPC水 0.1ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜， 再湿热灭菌。 2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫 氰酸胍、4mol/L LiCl等均用DEPC水配制。 3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液(pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L

31. 四、实验步骤 （一） 总RNA的提取（方案一） 1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取 1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状， 移入10 mL离心管。加入 4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL 苯酚 3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿 0.6 mL 混匀，冰浴放置30 min。 2. 4℃，8000 r/min，离心13 min。 3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。 4. 加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5 h。 5. 4℃，8000 r/min，离心13 min。

32. 三、操作操作步骤 1、制备兔抗鸡蛋清白蛋白血清 将鸡蛋清与生理盐水1：1 混匀后，与石蜡有完全佐剂和不完全佐剂研磨而成抗原，选择两只家兔，皮下多点注射3 次，每周一次，加强一次，每次四个点，每点0.2ml 抗原，5 周后颈动脉放血、取血清作为Western Blotting 的第一抗体。

33. 6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。 7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h。 8. 4℃，13000 r/min，离心15 min。 9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL 氯仿，混匀。 10. 4℃，13000 r/min，离心6 min。 11. 取上清，并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH 5.0），2 倍体积无水乙醇，-20℃，放置30 min。 12. 4℃，13000 r/min，离心20 min。 13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。 14. 将沉淀RNA室温下稍干燥。 15. 加30 uL DEPC水溶解，-70℃保存。

34. RNA 2 μl 甲醛 2.5 μl 甲酰胺 7.5 μl 10×MOPS 2 μl RNA Loading Buffer 2 μl 灭菌的DEPC 水 4 μl 1． 1.配制1.2%变性琼脂糖凝胶(40 mL) 2.称取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶 解，稍冷却加入甲醛3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h.RNA电泳 检测 混合液轻轻混匀并离心，放于65℃下温育 5 min后，置于冰上。

35. 3. 电泳检测 将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳30 min，然后在EB中染色15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。 五、注意事项 1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。 2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。

36. 思考题： 1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么? 焦碳酸二乙酯(DEPC), 吗啉代丙烷磺酸(MOPS), 异硫氰酸胍, 醋酸钠(NaAc), 氯仿, 苯酚, 甲醛, 乙醇, 乙二胺四乙酸(EDTA), 异丙醇