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Espectrometria de Massa : Fundamentos e aplicações em proteômica

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Espectrometria de Massa : Fundamentos e aplicações em proteômica. Dr. Luciano da Silva Pinto. Introdução. O que é Espectrometria de massa?

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Presentation Transcript
espectrometria de massa fundamentos e aplica es em prote mica

Espectrometria de Massa: Fundamentos e aplicações em proteômica

Dr. Luciano da Silva Pinto

introdu o
Introdução
  • O que é Espectrometria de massa?
    • É o estudo de sistemas que causam a formação de íons gasosos com ou sem fragmentação que é caracterizada então pela relação massa/carga e abundância relativa (Mede a massa de moléculas individuais que tenham sido convertidas em íons).
    • Relaçãom/z – unidade de massa atômica por unidade fundamental de carga
    • Em muitos casos, os íons encontrados no espectrômetro de massa possuem uma carga (z =1) e, então o valor m/z é numericamente igual à massa molecular iônica em unidades de massa atômica.
espectrometria de massa usada para
Espectrometria de Massa é usada para....
  • Biotecnologia: na análise de proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos, monitoramento de fermentação;
  • Agropecuária: Análise e controle de qualidade de rações;
  • Farmacêutica: Descobertas de novas drogas, farmaco-cinética;
  • Clínica: Análise da hemoglobina, teste de drogas;
  • Ambiental: Qualidade de água, contaminação em alimentos;
  • Geologia: Composição do petróleo, análise de solos;
  • Esportes: Identificação de esteróides;
  • Medicina Forense: Investigação de crimes
aplica o da espectrometria de massa em prote mica
Aplicação da Espectrometria de Massa em proteômica
  • Informação de massa molecular – Com precisão;
  • Identificação de proteínas usando massa molecular de peptídeos trípticos;
  • Informação Estrutural;
  • Sequenciamento de peptídeos;
  • Identificar modificações pós-traducionais (fosforilação, glicosilação e pontes de sulfeto).
hist ria da espectrometria de massa
História da espectrometria de massa
  • J.J. Thomson (University of Cambridge)
    • 1897: estudos da descarga elétrica de gases (descobrimento do elétron).

1906: Prêmio Nobel (construção do primeiro espectrômetro- espectrógrafo de parábola) para a determinação das razões massa-carga dos íons.

  • Francis W. Aston (University of Cambridge) 1922: Prêmio Nobel (estudos isotópicos com um novo espectrômetro de massa de maior resolução- íons dispersos pela massa e focalizados pela velocidade).
hist ria da espectrometria de massa6
História da espectrometria de massa
  • 1960- MALDI e ESI- Hillenkamp e Fenn (Prêmio Nobel)

Evolução

Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os inventores de métodos de ionização branda em espectrometria de massa - permitiu análise de macromoléculas

Koichi Tanaka (Japão) - Soft Laser Desorption (SLD).

John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI)

slide8

Espectrometria de massa

MODOS DE IONIZAÇÃO PARA BIOMOLÉCULAS

ANALISADORES DE MASSA

FTICR (Fourier Transform cyclotron resonance)

ION – TRAP

TRIPLE QUADRUPOLE

TIME OF FLIGHT (TOF)

Orbitrap

Setor magnético

ELECTROSPRAY

MALDI (matrix assisted laser desorption ionization)

slide10

Fonte de íons

Métodos agressivos

de ionização

(fragmentos podem não ser detectados)

Métodos suaves

de ionização

slide11

Ionização por electronspray(ESI)

  • Adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas.
  • Ionização ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente carregadas.
equil brio de estados m ltiplos da carga

Amina N-terminal

H

H

H

4+

M

E

H

F

R

W

G

K

H

4+

3+

2+

1+

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

Ionização por eletrospray

Equilíbrio de estados múltiplos da carga
origem do espectro de massa dos pept deos por esi
Origem do Espectro de Massa dos Peptídeos por ESI

m/z = (Mr+3H)/3

m/z = (Mr+H)

4+

3+

2+

1+

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

m/z = (Mr+4H)/4

m/z = (Mr+2H)/2

ES-MS

2+

3+

Rel. Inten.

1+

4+

vantagens do electrospray
Vantagens do electrospray

1) Apropriado para compostos carregados, polares e básicos;

2) Permite a detecção de compostos de alta massa

molecular - maioria dos espectrômetros de massas;

3) Melhor métodos para análises de compostos

multicarregados;

4) Baixo ruído químico permite ótimos limites de detecção;

5) Permite o controle de fragmentações;

6) Compatível com métodos de MS/MS

slide16

Ionização por MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

•A amostra é misturada com uma matriz que

absorva UV.

  • A matriz absorve energia do laser o que causa sua volatilização junto com a volatilização da amostra
vantagens do maldi
Vantagens do MALDI
  • Ionização suave – análise de biomoléculas intactas,
  • Extensa faixa de massa (> 400 kDa)
  • Análise de misturas - sem purificação
  • Alta sensibilidade
  • Fácil interpretação dos dados
  • Tampões e sais tem pouco efeito
  • Rápida
  • Fácil uso e manutenção
analisadores de massa
Analisadores de Massa
  • Após sua formação, os íons são acelerados para o analisador de massa através de um campo elétrico.
  • O analisador de massa separa os íons de acordo com suas razões m/z.
  • Os analisadores de massa podem ser contínuos ou pulsados:

Contínuos: transmitem um simples íon de razão m/z ao detector (quadrupolos e campo magnético).

Pulsados: coletam um espectro de massa inteiro a partir de um pulso simples de íons (TOF).

analisador tempo de v o tof
Analisador Tempo de Vôo (TOF)

Mede o tempo que íons de diferentes massas levam para

mover-se da fonte de íons até o detector:

Íons menores chegarão primeiro ao detector.

Existem dois tipos de analisadores TOF:

linear e refletor.

slide23

A equação que governa a separação de íons por TOF é:

m/z razão massa/carga do íonE potencial do pulso de extraçãos comprimento do setor em que E é aplicadod comprimento do tubo de vôot tempo de vôo do íon

MS-TOF

  • MS tempo de vôo:
  • Sem campo elétrico ou magnético,
  • Ao contrário de outros MS, não há limite superior de detecção de m/z.
  • É o mais preciso de todos os MS, permitindo análise elementar. Podem fazer até 100 espectros por segundo.
slide24

MS de setor magnético

Ionização: um feixe de elétrons de alta energia é utilizado para ejetar um elétron de uma molécula, formando um radical catiônico designado como íon molecular. Se o íon molecular for muito instável ele poderá se fragmentar em íons menores.

Analisador de massa: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos íons.

slide25

Analisadores de massa Quadrupolo

  • Quatro eletrodos, dois positivos e dois negativos.
  • A voltagem aplicada afeta a trajetória de íons passando através dos eletrodos. Para uma dada condição de corrente e voltagem, somente íons com uma determinada razão massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros são desviados para fora.
  • Obtém-se um espectro de massas variando-se gradualmente a corrente e voltagem para detectar-se todos os íons presentes.

MS quadrupolo de transmissão: consiste de um ionizador, lentes para acelerar e focalizar os íons para a entrada no quadrupolo, o quadrupolo com controles de V e A, um detector de íons. Todo o sistema necessita de alto vácuo.

Resolução: separa íons com diferenças de 0.3 m/z

slide26

ESQUEMA DE UM ESPECTROMETRO DE MASSA TRIPLO-QUADRUPOLO

IONIZAÇÃO: ELETROSPRAY - analíto e solvente são submetido a alta voltagem (3-4 kVolts)

Q1 : 1º QUADRUPOLO (DC/Rf) - modo MS (Q1) determina massa/carga (m/z) - molécula intacta

Q3 : 2º QUADRUPLO (DC/Rf) - modo MS/MS (Q3) detecta fragmentação dos ions - estrutura

CÉLULA DE COLISÃO: HEXAPOLO (somente Rf) Dissociação por colisão induzida - fragmetação

slide27

Analisadores de massa Íon-trap

MS Íon-trap: formado por um quadrupolo tridimensional

  • Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos, que formam dois “end caps” e um anel. Pode ser bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os eletrodos.
  • Face interna de cada eletrodo tem uma superfície hiperbólica.
  • Ainda que a resolução do MS ion trap seja mais baixa, apresenta como vantagem a pré-concentração do íon de interesse antes da análise.
analisador por resson ncia ciclotr nica de ons e transformada de fourrier fticr
Analisador por ressonância ciclotrônica de íons e transformada de Fourrier - FTICR
  • Consiste de três pratos paralelos dispostos na forma de um cubo, usados para capturar, excitar e detectar íons em uma célula pequena.
  • Os íons capturados, sob a influência de um campo magnético movem-se em uma trajetória circular de raio r e freqüência w:
orbitrap
Orbitrap

LTQ-Orbitrap

multiplicador de el trons
Multiplicador de elétrons
  • Multiplica uma corrente eletrônica, por aceleração de elétrons na superfície de um eletrodo.
  • A colisão libera um número de elétrons secundários maior que o número de elétrons incidentes. Os elétrons secundários são acelerados também por um outro eletrodo que por sua vez libera outros elétrons secundários e assim por diante, resultando em uma amplificação do sinal.
placa de micros canais mcp
Placa de Micros Canais (MCP)
  • Um arranjo de capilares de vidro
  • paredes internas
  • material condutor de energia elétrica
  • alta voltagem
  • íon que colidir na parede interna dos capilares criará uma avalanche de elétrons secundários
aminoacidos s o ligados por liga es pept dicas para formar a cadeia polipept dica
Aminoacidos são ligados por ligações peptídicas para formar a cadeia polipeptídica

Uma cadeia de polipeptídeos tem duas regiões terminais (amino- ou N-terminal e carbox- ou C-terminal) e possui uma espinha dorçal regularmente repetida mas com diferentes resíduos (R1, R2, R3, R4, R5)

massa molecular de um pept deo proteina
Massa Molecular de um Peptídeo/Proteina

Mr = Soma de todas as massas dos resídos + 18 (H2O)

slide42

A massa de uma molécula pode ser determinada a partir dos m/z de quaisquer dois picos vizinhos, que diferem por 1 carga (+) ou 1 próton:

(m/z)1 = M + n2x

n2

M é a massa da molécula

n2 é o número de cargas

X é a diferença entre dois picos

(m/z)2 = M + (n2x +1)X

n2 + 1

Temos duas equações e dois desconhecidos, M e n2, que podem ser calculados resolvendo-se esse sistema de equação:

n2 = (m/z)2 – X

(m/z)2 – (m/z)1

M = n2 [(m/z)2 – X]

O espectro de massas de uma molécula consiste de uma família de picos, correspondendo a espécies carregadas que diferem de 1 unidade de massa e carga.

A “deconvolução” desses picos, gerando o gráfico acima, dá a massa de uma molécula com precisão de 0,01%

slide43

Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas

Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos.

2 etapas de MS acopladas.

Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases.

Os fragmentos são então separados e analisados por MS.

hélio ou argônio

A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.

slide44

Sequenciamento de novo de proteínas

Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.

slide45

Sequenciamento de novo de proteínas

A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y.

slide46

Espectro MS/MS do peptídeo tríptico GLSDGEWQQVLNVWGK.

Analisa-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer a seqüência do peptídeos

pesquisa em bancos de dados

PROTEIN ID: serum albumin precursor (BOVINE)

Pesquisa em bancos de dados

A pesquisa em banco de dados foi realizada com submissão de massa/carga de 7 mais intensos peptídeos demonstrados no espectro de massa da figurae o programa ProteinProspector foi acertado para a menor especificidade possível, sem nenhuma restrição ao peso molecular, ponto isoelétrico e cadeia taxonômica. A pesquisa envolveu 983900 entradas, sendo que BSA foi prontamente identificada.

slide48

Proteínas são identificadas inserindo-se a massa dos peptídeos em um banco de dados de peptídeos como o ProFound.

  • Parâmetros de busca são refinados incluindo massa e ponto isoelétrico determinados por 2D PAGE.
  • http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/profound.htm
slide55

http://prospector.ucsf.edu/

http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html 

http://www.ionsource.com/