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第八章 荧光免疫技术

第八章 荧光免疫技术. 第一节 概述. 荧光的基本知识. 荧光（ fluorescence ）. 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。. 荧光的基本知识. 发射光谱和激发光谱. 发射光谱 是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱 是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。. 荧光的基本知识. 荧光效率. 定义 : 荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率 计算公式 : 荧光效率 =. 荧光的基本知识. 荧光寿命.

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第八章 荧光免疫技术

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Presentation Transcript

  1. 第八章 荧光免疫技术

  2. 第一节 概述

  3. 荧光的基本知识 荧光（fluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

  4. 荧光的基本知识 发射光谱和激发光谱 • 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 • 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。

  5. 荧光的基本知识 荧光效率 定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率 计算公式: 荧光效率=

  6. 荧光的基本知识 荧光寿命 • 定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 • 各种荧光物质的荧光寿命不同。

  7. 荧光的基本知识 荧光淬灭 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。

  8. 荧光物质 荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 常用的荧光物质

  9. 第二节 荧光抗体技术

  10. 荧光抗体技术的基本原理 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后 荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位， 对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行 定性和滴度测定。

  11. 荧光抗体技术的内容 标本制作 荧光抗体制备 荧光抗体染色 荧光显微镜检查

  12. 标本的制作 标本的类型 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞

  13. 标本的制作 组织切片的类型 • 冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 • 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。

  14. 标本的制作 标本的固定和保存 • 固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 • 保 存：4℃、-20℃

  15. 荧光抗体的制备 抗体要求 高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG

  16. 荧光抗体的制备 荧光素要求 • 有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 • 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 • 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 • 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 • 标记方法简单、安全无毒。 • 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

  17. 荧光抗体的制备 抗体的荧光素标记 • 标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 • 标记方法: • 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 • 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低

  18. 荧光抗体的制备 荧光抗体的纯化 • 去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 • 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 • 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收

  19. 荧光抗体的制备 荧光抗体的鉴定 • 荧光素与蛋白结合率： F/P= • 抗体效价：双向免疫扩散试验 • 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 • 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释

  20. 荧光抗体的制备 荧光抗体的保存 • -20℃：保存1～2年 • 真空干燥：长期保存

  21. 荧光抗体染色 直接法 荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。 直接荧光抗体染色法示意图

  22. 荧光抗体染色 间接法 特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。 间接荧光抗体染色法示意图

  23. 荧光抗体染色 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。

  24. 荧光显微镜检查 荧光显微镜 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

  25. 荧光显微镜检查 荧光显微镜 • 光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 • 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 • 光路：透射光、落射光 • 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 • 镜头：消色差镜头

  26. 荧光显微镜检查 荧光显微镜 滤光片 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。

  27. 荧光显微镜检查 荧光显微镜 光路 透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。 透射荧光显微镜光路(a) 落射荧光显微镜光路(b)

  28. 荧光显微镜检查 荧光抗体染色结果判断 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型

  29. 荧光显微镜检查 荧光抗体染色结果判断 “-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

  30. 第三节 荧光免疫分析的类型

  31. 荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪 检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量 或超微量物质进行定量测定。

  32. 荧光免疫技术的类型 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光抗体技术 均相荧光免疫测定 （homogeneous fluorescence immunoassay） 荧光免疫技术 荧光免疫测定 非均相荧光免疫测定 （heterogeneous fluorescence immunoassay）

  33. 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定

  34. 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 时间分辨 • 自发荧光寿命短:1ns～10ns • 镧系元素寿命长:10μs～1000μs • 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 时间分辨检测原理示意图

  35. 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 stokes位移 • stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 • 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠

  36. 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 发射光谱和激发光谱 • 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 • 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高

  37. 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 荧光标记物的相对比活性 • 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 • 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高

  38. 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 信号增强 Eu3+标记抗原抗体复合物 酸性增强液 结合β-二酮体 Eu3+解离 荧光增强

  39. 时间分辨荧光免疫测定 常见荧光物质的荧光寿命 标记物 镧系元素 • 铕(Eu3+)（最常用） • 钐(Sm3+) • 铽(Tb3+) • 钕(Nd3+) • 镝(Dy3+)

  40. 时间分辨荧光免疫测定 标记方法 双功能螯合剂： • 1-（对-苯偶氮）-EDTA • 异硫氰酸苯基-EDTA • 异硫氰酸苯甲基-DTTA • 二乙烯三胺五乙酸（DTPA） 标记方法： • 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 • 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+

  41. 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 • 双抗体夹心法 • 固相抗体竞争法 • 固相抗原竞争法

  42. 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检 抗原结合，形成固相抗体-待检 抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性 增强液下，Eu3+解离，340nm激发 光下发射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图

  43. 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧 光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。

  44. 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体， 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强 度，荧光强度与待检抗原含量成反比。

  45. 时间分辨荧光免疫测定 方法评价 • 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L • 分析范围宽：4～5个数量级 • 标记物稳定：有效使用期长 • 测量快速，易自动化 • 易受污染，本底增高

  46. 荧光偏振免疫测定 基本原理 偏振光(蓝光,485nm) 光线通过偏振滤光片后， 形成一个方向的平面光称 为偏振光。 荧光物质 偏振荧光(绿光,525nm～550nm)

  47. 荧光偏振免疫测定 抗原抗体竞争反应 • AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 • AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 • 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 • 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比 基本原理 荧光偏振免疫测定原理示意图

  48. 荧光偏振免疫测定 方法评价 • 样品用量少 • 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 • 重复性好 • 快速，易自动化 • 适于小、中等分子物质检测 • 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低

  49. 荧光酶免疫测定 基本原理 碱性磷酸酶标记抗体或抗原， 固相载体包被抗原或抗体， 酶分解4-MUP，脱磷酸根基团 形成4-MU，360nm激发光照 射，发出450nm荧光。 荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图

  50. 荧光酶免疫测定 酶和荧光底物 荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物

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