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非蛋白含氮化合物的测定

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非蛋白含氮化合物的测定. 血清非蛋白含氮化合物是指除蛋白质以外的一切含氮化合物的总称。 ( nonprotein nitrogen , NPN ) 包括:尿素、尿酸、氨基酸和其他物质 如肌酐、嘌呤、嘧啶等。. 尿素的测定. 尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。在旰内合成(线粒体),经血液运输至肾,经肾小球滤过和肾小管重吸收后排出体外。在摄入食物及体内分解代谢较稳定的情况下,其血浓度取决于肾排泄的能力,是常用的肾功能指标。. 尿素的测定 二大类: 1. 直接法:尿素直接与试剂作用,测定

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血清非蛋白含氮化合物是指除蛋白质以外的一切含氮化合物的总称。血清非蛋白含氮化合物是指除蛋白质以外的一切含氮化合物的总称。
  • (nonprotein nitrogen,NPN)
  • 包括:尿素、尿酸、氨基酸和其他物质 如肌酐、嘌呤、嘧啶等。
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尿素的测定
  • 尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。在旰内合成(线粒体),经血液运输至肾,经肾小球滤过和肾小管重吸收后排出体外。在摄入食物及体内分解代谢较稳定的情况下,其血浓度取决于肾排泄的能力,是常用的肾功能指标。
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尿素的测定

二大类:

1.直接法:尿素直接与试剂作用,测定

其产物. 最常用的是二乙酰一

肟法。

2.酶法(间接法):

a.全酶法:酶偶联法

b.半酶法:纳氏法、波氏法、干片法、

离子选择性电极法

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1. 二乙酰一肟法(直接法):

原理: H+

二乙酰一肟 + H2O 二乙酰 + 羟胺

H+

二乙酰 + 尿素 4,5二甲基-2-氧咪唑

  • (红色)

540nm比色

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2.酶法( 间接法 ):

利用尿素酶催化尿素水解生成铵盐,铵盐再与其他试剂进行反应.

a.纳氏试剂显色法:

尿素酶 NaOH

尿素 + H2O ( NH4 )2CO3 NH3

NH3 + 纳氏试剂(HgI2.2KI) NH2.Hg2I3

(棕黄色)

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b.波氏法( 酚-次氯酸盐显色法):

1.尿素酶水解尿素生成氨(NH3)

2.氨和酚及次氯酸盐在碱性环境中作用形成对-醌氯亚铵

3.对-醌氯亚铵与另一分子的酚作用,碱性溶液中形成吲哚酚(兰色解离型)

630nm比色

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c.酶偶联法: 尿素酶-谷氨酸脱氢酶偶联
  • 尿素酶
  • 尿素 + H2O NH3
  • GLDH
  • NH3 + a-酮戊二酸 + NADH + H+
  • 谷氨酸 + NAD+ + H2O
  • 340nm比色
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d.干片定量法:
  • 使用多层分析膜.这类膜由不同功能的几部分粘合成一体,膜的结构随测定成分不同而异.
  • 该法操作简单,节省时间、试剂,干扰少,但应避免标本溶血。
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酶法优点:反应专一、特异性强、不受

尿素类似物的影响。

  • 缺点:操作费时且受体液中氨的影

响,因 此在含铵盐较多的尿

液中测定尿素时必须先除去

多余的尿氨。

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尿酸的测定
  • NPN成份之一,核酸中嘌呤分解代谢的最终产物。
  • 以酮式和烯醇式二种互变平衡的形式存在。烯醇式有酸性,具还原作用。
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基于原理:

1.在碱性环境中尿酸具有还原性,可进行

氧化还原反应。

2.利用尿酸酶水解,使尿酸生成尿囊素及

H2O2后进行测定。

  • 二大类:(一)氧化还原法

(二)尿酸酶法

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(一)氧化还原法:

1.磷钨酸法:碱性条件下尿酸具有还

原性

尿酸 + 磷钨酸 尿囊素 + CO2 + 钨蓝

(蓝色)

*需采用无蛋白血滤液

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2.杂菲铁法:

尿酸以三氯化铁(FeCl3)为氧化剂。在尿酸被氧化时高价铁(Fe3+)还原成低价(Fe2+), Fe2+与1,10-二氮杂菲形成复合物在505nm有最大吸收峰,颜色强度与尿酸含量成比例,可定量测定。

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氧化还原法的共同点是在尿酸被氧化的同时使金属化合物中的金属离子还原为低价。氧化还原法的共同点是在尿酸被氧化的同时使金属化合物中的金属离子还原为低价。

缺点:1.特异性不高:谷胱甘肽、半胱氨

酸、酪氨酸、酚、葡萄糖等都

有干扰作用。

2.显色、褪色速率变动不定、灵

敏度低。

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(二)尿酸酶法:

尿酸酶

尿酸+O2 + H2O 尿囊素+CO2 + H2O2

1.紫外分光法。

2.酶联比色法。

3.酶联-紫外分光法。

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1.紫外分光法:

尿酸在282~292nm有吸收峰,经尿酸酶作用后产物在此波长内无光吸收,计算酶作用前后的吸光度差值,标准品和样品同处理可计算尿酸含量。

该法灵敏度高、特异性好、无干扰,

可直接用血清测定,不需沉淀蛋白质,易于自动化,简单快速。

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2.酶联比色法:

尿酸经尿酸酶作用生成H2O2,用过氧化物酶(POD)使H2O2氧化还原型的色素原成为氧化型而显色。

色素原:a.3-甲基-2-苯并噻唑啉酮(MBTH)

和N,N-二甲基基胺( DMA)生

成偶氮色素600nm有光吸收。

b.2-羟-3,5-二氯苯磺酸和4-氨基

安替比林生成红色醌亚胺类化

合物,500nm有最大光吸收可定

量比色。

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3.酶联-紫外分光法:

尿酸酶

尿酸+2H2O + O2 尿囊素 + CO2 + H2O2

过氧化氢酶

H2O2+CH3CH2OH CH3CHO+2H2O

乙醇 乙醛

醛脱氢酶

CH3CHO + NAD+ + H2O

CH3COOH + NADH + H+

乙酸

340nm测定NADH产生的光吸收

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实验80 脲酶-波氏比色法

[原理]

脲酶水解尿素生成氨,氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应,生成兰色的吲哚酚阴离子,其生成量与尿素含量成正比。此反应需亚硝基铁氰化钠催化,生成物在630nm处有吸收峰。

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[试剂]
  • 1.脲酶:
  • 水解尿素生成氨。
  • 2.碱性次氯酸钠:
  • 提供碱性环境,并可与酚显色剂 作用生成吲哚酚。
  • 3.酚显色剂:
  • 含催化物质亚硝基铁氰化钠,催化显色剂与次氯酸钠反应。
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[操作] 见书
  • [注意事项]
  • 空气及试剂中的氨可明显干扰尿素的测定,使结果增高。高浓度氟化物可抑制脲酶,引起结果偏低。