第二章 冷冻干燥的基本理论

1. 第二章 冷冻干燥的基本理论

2. 2.4 升华干燥过程 • 升华干燥，也称一次干燥,是将冷冻后的物料置于干燥室中，进行加热，同时用真空泵抽空，物料中的冰晶就会升华成水蒸汽而逸出,使物料干燥。 • 升华是从外表面开始逐步向内推移的，冰晶升华后留下的是多孔的干燥层。干燥层和冻结层的分界面称为升华界面(sublimation front)或冰峰(ice front)。 • 升华所需的热量,可以是辐射通过多孔干燥层向内传入；也可以导热通过冻结层传入；或者用微波对物料直接加热。升华的水蒸汽通过多孔干燥层中的空隙逸出。 • 因此，传热传质在升华过程中同时发生。当物料中的全部冰晶已通过升华而被除去时，升华干燥结束。此时，物料中最初水分的90%以上已被除去。

3. 1. 冷冻干燥过程中传热传质的典型形式 • (a) 热量完全从底部的冻结层导入；升华的水蒸汽只能沿顶部方向扩散出去。 • (b)热量完全从顶部多孔干燥层传入；升华的水蒸汽以相反的方向也从顶部扩散出去。 • (c)热量从底部冻结层和顶部多孔干燥层同时传入；升华水蒸汽只能从顶部干燥层扩散出去。多层搁板式冻干机的加热方式近似于此种方式。 • (d)热量从上下两侧的多孔干燥层同时传入；升华的水蒸汽以相反方向从两侧扩散出去。物料内有两个升华界面。 • (e)热量在物料内部产生，升华的水蒸汽从两侧传出。用微波加热时，属于此种传热传质方式。 • （f）是对应球形或长圆柱状物料的传热与传质方式。

4. 2. 热量传递 （1）固体导热加热 物料放在料盘上，料盘与加热搁板直接接触。热量穿过物料盘、物料的冻结层而到达升华界面。在接触式传导加热的冻干设备中，不仅要求加热板与料盘具有良好的导热性能，还要求加热板、料盘和物料之间接触良好，这样才能提高传热效果，并使热量均匀分布。

5. （2） 辐射与微波加热 • 辐射是物体通过电磁波来传递能量，可以在真空中进行。物料悬于上、下两块搁板之间，与搁板不直接接触；热量通过上、下搁板向物料表面辐射，再通过干燥层的导热到达升华表面。 • 在辐射加热的冷冻干燥设备中，不要求物料、容器（料盘）与搁板紧密接触，这样就便于实现物料整车进出干燥室，现在这种加热方式被广泛用在大型冷冻干燥设备中。 • 微波加热也属于电磁波加热，但与辐射加热不同，微波加热是物质本身直接作为发热体，不需要从外部把热量传递到内部，因此物料中心升温快。由于微波加热基本不受干燥层的影响，热量能直接达到物料的升华面，因而物料表面和升华界面之间的温差很小，可使冷冻层维持低于并接近物料允许的最高温度。

6. （3）对流加热 • 由于冷冻干燥是在接近真空的条件下进行，因此对流传热所起的作用很小，但近些年来常采用循环压力法来实现强制对流传热以加速一次干燥的过程。所谓循环压力法，也就是控制真空系统的压力在一定范围内上下波动，以提高传热传质的效果。

7. 3.质量传递 • 升华干燥中，将有大量的水蒸汽从物料中升华出来。这些水蒸汽必须被及时移走，否则冻干室内水蒸汽压将升高，升华界面温度也随之升高，导致冰融化。 • 升华产生的水蒸汽首先通过干燥层内部的扩散过程到达物料表面，再靠压差的作用到达冷阱,重新结成霜。 • 冷冻干燥中，冷阱应保持足够低的温度，以保证升华出来的水蒸汽有足够的扩散驱动力。实践表明，对于多数物料的冷冻干燥，冷阱表面温度在-40～-50℃之间已能满足要求。而对于某些玻璃化转变温度（或共晶点温度）较低的物料，冷阱表面温度必须足够低，以保证水蒸汽的扩散驱动力。 • 真空泵的主要作用是抽取系统中物料释放出来的不凝性气体和外部渗漏进来的气体。

8. 4. 物料中水分的分布 物料中水分的含量，一般常用的表示法有两种： • 一种是物料的含水量w，是指湿物料中的含水量，又称湿基含水量， 。w的数值可以从0至100%。 • 另一种是干物料的含水量m， ，又称干基含水量。其数值可以从0至远大于100%。 • 显然存在下列关系：

9. 理想情况下，冻结层与干燥层之间存在着明显的界面，冻结层的水分含量为w0，干燥层的水分含量we。从冻结层到干燥层的界面上，水分含量有突然的下降。冰升华为水蒸汽，是在此分界面上进行，故此分界面又称为升华界面。随着干燥的进行，升华界面逐渐向物料内部移动。当冻结层厚度为零时，升华界面完全消失，升华干燥过程结束。理想情况下，冻结层与干燥层之间存在着明显的界面，冻结层的水分含量为w0，干燥层的水分含量we。从冻结层到干燥层的界面上，水分含量有突然的下降。冰升华为水蒸汽，是在此分界面上进行，故此分界面又称为升华界面。随着干燥的进行，升华界面逐渐向物料内部移动。当冻结层厚度为零时，升华界面完全消失，升华干燥过程结束。 • 实际情况下，在干燥层内存在着一定的湿度梯度；而且在冻结层与干燥层之间存在着一个过渡层，此层内虽然不含冰晶，但水分含量明显高于干燥层。

10. 2.5 解吸干燥过程 • 二次干燥是在真空的条件下对已经过升华干燥的物料再进行升温加热，主要是取走被物料吸附的束缚水；加热量主要用于被束缚水的解吸作用和蒸发。 • 一次干燥和二次干燥的作用、机制和工艺操作参数是截然不同的。因此，如何判断一次干燥已经结束，和开始进行二次干燥是十分重要的。过早或过晚进行“切换”，都会造成冻干品质的降低；或能量和时间的消耗。 • 在二次干燥过程结束时，物料中的含水量应当达到最终要求的剩余含水量。冻干后物料中的剩余水分含量过高或过低都是不利的。剩余含水量过高不利于长期贮存；过低也会损伤物料的活性。经二次干燥后，冻干后物料中的剩余水分含量一般应低于5%。

11. 2.6 冻干物料的储存 • 冷冻干燥的主要目的是增强制品的稳定性，即通过减缓生物生长或化学反应，使制品的生命期由几小时或几天延长到几个月甚至几年。但是，即使在冻干过程结束时冻干品是稳定的，在长期的贮存过程中也有可能会失去活性。 • 冻干品的品质变化包括物理、化学以及微生物等方面的变化。物理方面，如蛋白质凝聚等；化学方面如去氨基、褐变（Maillard反应）、氧化、水解等。

12. 1.影响制品稳定性的因素(1) 残余水分含量 • 残余水分含量经常控制着蛋白质的稳定性，既包括物理方面的又包括化学方面的。水可以作为反应物直接参与反应，也可以作为增塑剂或反应媒介来间接影响冻干品的稳定性。尽管冻干品的含水率很低，若酶活性未被钝化，仍会发生酶促反应。 • 作为增塑剂，水可以大大降低冻干品的玻璃化转变温度。如按 Gordon-Taylor方程来进行估算，水分含量每增加1%，玻璃化转变温度Tg将下降5-10℃。 • 在贮存过程中，冻干品也很容易吸湿使玻璃化温度降低到贮存温度以下，从而加速它的不稳定性，甚至引起塌陷。冻干品的水分含量会因各种原因而发生改变，如包装材料的泄漏、瓶塞水分释放、无定形成分的结晶等。

13. (2)储存温度 • 温度对固体制剂稳定性的影响较复杂，一般来讲，温度越高，稳定性越差。温度高，将加速蛋白质的物理凝聚，这主要是因为高温时蛋白质分子活动性增强，加剧蛋白质之间的相互作用。温度升高时，已冻干的食品、药物或一些辅料会熔化,以及出现多晶型转变或水分减少等问题。另外，高温也会使化学反应加快，引起物料降解。 • 实际中物料是缓慢吸湿的，其相应的塌陷温度逐渐下降。当塌陷温度低于贮存温度时，物料会出现结块、变色、变味现象。贮存环境温度应该根据食品剩余水分和含糖成分等确定，一般说来，温度低些总是有利的。

14. (3) 包装材料 • 若药物制剂不考虑包装，即使对于最稳定的处方，也不能得到优质的成品。药物贮存于室温环境中，主要受热、光、水汽及空气（氧）的影响，包装设计就是要排除这些因素的干扰。同时也要考虑包装材料与药物制剂的相互作用。包装容器材料通常使用的有玻璃、塑料、橡胶及一些金属。

15. 1） 玻璃容器 玻璃理化性能稳定，不易与药物作用，不具透气性，为目前应用最多的一类容器。但它有两个缺点，即可能释放碱性物质和脱落不溶性玻璃碎片，这些问题对注射剂特别重要。棕色玻璃能阻挡波长小于470nm的光线透过，故光敏感的药物可用棕色玻璃包装。

16. 2）塑料 • 塑料是聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯和聚碳酸酯等一类高分子聚合物的总称。为了便于成形或防止老化等，常常在塑料中加入增塑剂、防老化剂等附加剂。有些附加剂具有毒性，药用包装塑料应选用无毒塑料制品。 • 塑料容器存在以下问题： a．具有透气性。制品中的气体可能与大气中的气体进行交换，而使冻干品氧化、挥发。 b．具有透湿性。如聚氯乙烯膜，当膜的厚度为0.03mm时，在40℃、90%相对湿度条件下透湿速率为100 g/(m2·d)。 c．具有吸着性。塑料中的物质可能迁移进入物料；同时制品中的物质（如防腐剂）也可以被塑料吸着，如尼龙就能吸着多种抑菌剂。 • 高密度聚乙烯，其刚性、表面硬度、拉伸强度都较大；熔点、软化点也较高；水蒸汽与气体透过高密度聚乙烯的速率很低。所以，许多冻干品的包装采用了高密度聚乙烯定形容器。

17. 3）橡胶 • 橡胶主要用作玻璃容器的塞子，目前被广泛使用。 • 在橡胶成形过程中, 加入了一些硫化剂、填充剂与防老剂等。在使用时这些添加剂可能污染冻干品；另外，橡胶也可能吸附药物中的主药和抑菌剂。特别是橡胶对于抑菌剂的吸附，会使抑菌效能降低。 • 橡胶塞子中也会含有一定量的水份。贮存过程中橡胶塞子中水分的释放，会对冻干品的品质产生一定的影响。试验发现，对于橡胶塞子的瓶装215mg的蔗糖冻干品，在室温下贮存3个月，冻干品的水份含量从1.95％提高到2.65％。在平衡状态下，水分从瓶塞中的解吸、水分被冻干品的吸收等过程，是与瓶塞的材料、瓶塞中水分含量以及冻干品的吸湿能力有关的；而且聚合物、橡胶硫化过程中的添加剂、填料，也都会影响瓶塞对水分的吸收和解吸。

18. 橡胶塞子的含水量，在很大程度上是与它“ 经历的历史”有关的。一般说来，经过蒸汽消毒的橡胶塞子，会吸收它本身重量1.1％的水份。这些水份要通过8个小时的真空干燥，或8小时的热空气干燥（110 ℃）才能降到0.1％。经蒸汽消毒后的塞子经过8小时的真空干燥后，释放给乳糖的水份（曲线3），要比经蒸汽消毒后没有经干燥处理的塞子传给乳糖的水份（曲线1）少得多。 瓶装冻干乳糖的水分含量与贮存时间和橡胶塞子处理方式的关系

19. (4) 玻璃化转变温度 • 玻璃化转变温度可用来判断冻干品的稳定性。一般来说，冻干品的玻璃化转变温度越高，制品越稳定。但玻璃化转变温度受水分含量、热历史等因素的影响而发生变化，即使对同样的物料，冻干后的可能也会有所不同。水分含量越少，值越高。 • 应当如何选择贮存温度，才能使冻干品长期保持稳定? Frank认为，贮存温度至少应该比玻璃化转变温度低20 ℃，也就是说，如果希望在常温下（25℃）保持冻干品的稳定性，那么物料的玻璃化转变温度值高于45 ℃。

20. (5) 其他 • 药物多晶型 • 处方中基质、复形剂与药物之间的相互作用 • 无定型保护剂的结晶 • 此外，冻干溶液的浓度、PH值、瓶内填充气体的特性以及光照等因素均会对冻干品的稳定性造成一定的影响。

21. 2.残余水分含量 • 在贮存过程中，残余水分含量对制品的稳定性有至关重要的影响。冻干生物制品的最终要求的剩余含水量（final requested residual moisture）通常控制在1.0%～3.0%（wt/wt）之内，过多或过少的水分含量都会影响冻干品的质量。例如，过分干燥将导致活细胞死亡；而水分过多会导致蛋白质分子结构发生改变，而影响其活性。对冻干产品的含水量控制是十分重要的。

22. 防止封装过程的再吸湿 • 为了维持较低的水分含量，还必须防止冻干品在封装过程中再次吸湿。例如，在冻干结束时立即将冻干室（如200升）直接打开，而进来的是20℃、相对湿度为70%的空气。此空气的水分含量为1.3×10-2 g/L，它则会将2.6g的水蒸汽带进冻干室。如果干燥室中置有300个容积为1cm3的小瓶，每个小瓶中盛有1g的固体物料，那么待平衡时冻干物料的残余水分含量将可能增加0.9%左右。 • 瓶装的冻干品最好在干燥箱中直接加盖密封。对于体积较大的物料或是食品，干燥过程结束后，要向干燥室充入惰性气体。如果充入的是干空气，那么此干空气中含水蒸气的量必须极少。

23. 冻干物料中水分含量的测量方法 • 常用的测量方法有重量测定法、Karl Fischer法、热重分析法等。 • 在所有测量冻干品残余水量的方法中，都必须确保冻干品不再从周围环境吸收水分。例如，当把冻干品从一个容器转移到另一个容器，或者对冻干品进行称重，都必须在充满惰性气体或干燥气体的隔离箱中进行，以防止冻干品吸湿。我们也可以在隔离箱中放置五氧化二磷，以保证干燥。操作时要带上固定在箱体上的橡胶手套。

24. 重量测量法(Gravimetric Method) • 原理：将被测产品放在真空容器中，在规定温度和湿度下，用五氧化二磷作干燥剂吸收水蒸汽，从干燥过程中物料重量的减少来计算产品的含水量。此方法主要用来测量表面水和松散的束缚水。 • 重量测量法要求房间内的空气相对湿度维持在20～25%，温度为20～25℃。实验装置包括分析天平、真空泵、电阻真空计、湿度计、干燥器等。测量前预先称得空瓶重量G0；将冻干物料放至瓶中，在天平上称得重量G1；然后置入干燥器中，用真空泵抽空，直至干燥器中的压力低于13Pa；将干燥器密封，在真空状态下放置三天后，通入干燥空气，再次称得重量G2，被测物料中的含水量（%）用下式计算 • 含水量= • 用重量测量法来测量物料中水分含量时，待称重的冻干品必须在100mg以上，必要时可以将几个小瓶中的冻干品放在一起来称量。

25. 卡氏滴定法 (Karl Fischer Method) 卡氏滴定法属于碘量法的一种，是德国人Karl Fischer在1935年发明的。此法可以测量气体、液体、固体物料的水分。原理是利用水与Karl Fischer试剂的化学反应，根据容量分析法来确定含水量的。Karl Fischer试剂是由碘、二氧化硫、吡啶以及甲醇组成。 原理：碘氧化二氧化硫时需要一定量的水参与反应 I2+SO2+2H2O → 2HI+H2SO4 I2+SO2+H2O+3RN+R1OH → 2RNHI+RNSO4R1 此试剂中的碘起定量试剂作用；吡啶用来中和反应中产生的酸性物HI和H2SO4以确保反应的顺利进行 ；二氧化硫是与碘结合，起到防止试剂蒸发的功能；甲醇既参与反应又作为反应生成物的溶剂。用卡氏滴定法测量时，所需的样品量可以比重量分析法要少2-4倍。

26. 用卡氏滴定法来测量冻干品的残留水分含量时，先将称重后的冻干品溶于甲醇溶液中，用Karl Fischer试剂进行滴定直到溶液由棕色变成黄色(甲基硫酸化合物(RNSO4R1))时为止。 • “永停法”来判定卡氏反应的终点：在反应溶液中插入双铂电极，在两电极之间加上一固定的电压，若溶剂中有水存在时，则溶液中不会有电对存在，溶液不导电，当反应到达终点时，溶液中存在I2和I-电对，即： 2I- = I2+2e • 因此，溶液的导电性会突然增大，在设有外加电压的双铂电极之间的电流值突然增大，并且稳定在我们事先设定一个阈值上面，即可判断到了滴定终点，机器便会自动停止滴定，从而通过消耗KF试剂的体积计算出样品的含水量。

27. 物料中含水量 式中： a- 滴定所需的Karl Fischer试剂，ml； f- Karl Fischer试剂的滴定度，mg/ml； m - 物料质量，mg； 以下几种情况不适合用卡氏滴定法测量： • 冻干品与Karl Fischer试剂中碘会起化学反应； • 冻干品不溶于甲醇； • 水分无法用甲醇提取出来。

29. 热重（量）分析法(Thermogravimetry) 热重分析法是测量试样的质量变化与温度关系的一种技术。热重曲线是用热天平记录的。热天平是由微量电天平、炉子、温度程序器、气氛控制器以及同时记录这些输出的仪器等部件所组成。测量时，将质量约在5-11mg范围内的样品放在样品盘上。在程控升温（如以10℃/min，从30℃升高至 180 ℃）时，热重曲线能纪录样品的质量损失的过程。

30. 此外，用来检测冻干品残余水分含量的方法还有气相色谱法、水分分析仪、近红外线光谱法、氚同位素法等。此外，用来检测冻干品残余水分含量的方法还有气相色谱法、水分分析仪、近红外线光谱法、氚同位素法等。 • 用重量法测出的冻干品的残留水分含量，比用卡氏滴定法测量的结果要低0.3％－0.6％左右；而用热重法测量的结果与用卡氏滴定法测量的结果比较接近。

31. 3.冻干品稳定性的加速试验测定方法(1) 长期试验 • 药品的有效期或贮存限期，是指该药品存放在规定容器或包装中，并在标签制定的条件下，贮存规定的时间后，药品仍然能够保持符合批准的质量标准的贮存时间。为了测定冻干物料的有效期，必须对它们进行长时间的稳定性试验。 • 在各种稳定性预测的试验方法中，以室温留样的长期试验最能准确地反映出实际情况，是制定制品有效期的依据。但其缺点是费时太长（数月至数年），不利于及时发现与纠正出现的问题。 • 长期试验是在药品的实际贮存条件下进行，其目的是为制定药物的有效期提供依据。市售包装，在温度25±2℃，相对湿度60%±10%的条件下放置12个月。每3个月取样一次，分别于0、3、6、9和12个月，按稳定性重点考察项目进行检测。如12个月后仍需继续考察，则分别于18、24和36个月取样进行检测。将结果与0月时的取样进行性能比较，以确定药品的长效期。

32. (2) 加速试验 • 加速试验（accelerated testing）是在超常的条件下进行。其目的是通过提高温度（如37℃或 42℃）、加强光照等方式，以加速药物的化学或物理变化，为药品包装、运输及贮存提供必要的资料。 高温加速试验 • 按市售包装，在温度40±2℃（或 37±2℃），相对湿度75%±5%的条件下放置六个月。所用设备温度的控制精度为±2℃，相对湿度的控制精度为±5%，并能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间分别于第1、2、3、和6个月取样一次，按稳定性重点考察项目检测。

33. 光照加速试验 • 分别装入透明容器内，放置在光橱，或其他适宜的光照仪器内，在照度4500±500lx的条件下放置10天，于5天、10天时取样，按稳定性重点考察项目进行检测，特别要注意供试品的外观变化。 • 关于光照装置，建议采用定型设备“可调光照箱”；也可采用安装日光灯的光橱。橱中试品台高度可以调节，橱上方安装抽风机以排除可能产生的热量。另外还配有照度计，可随时检测橱内照度。光橱应不受自然光的干扰，并保持照度的恒定。

34. 高温加速试验的理论 • 药物的降解速率（degradation rate）和温度之间的关系，可以用Arrhenius式表示 式中，k——反应速率； Ea——活化能（Activation energy）； R——通用气体常数，8.314 ； T——绝对温度。 或

35. 设药物在室温T0、两个高温温度T1和T2（ ）下降解10%的时间分别为t0、t1、t2，（ ）。 由高温加速试验数据推算正常有效期 • 药品的有效期是和降解速率成反比的。如在两个不同温度 T1和 T2下的降解速率分别为k1和k2；有效期分别为 t1和t2，按照Arrhenius式可得

37. 例如选择室温 为 25 ℃；两个高温温度， T1为 40℃； T2为 50℃。使药物在此二温度下恒温降解，定时取样测含量。然后作此二温度下药物的降解情况与贮存天数t的关系图，c为药物在时间t时的浓度。由图上分别找出二温度下药物降解10%(药物浓度为90%,lg90=1.954)的时间分别为t1=80d和t2=40d。求室温为25 ℃时，药物降解10%所需的时间（即有效期）。

38. 得室温下降解10%所经历的时间，即有效期

39. 高温加速试验的限制 • 高温加速试验的温度是有限制的。如温度过高，会引起其他的变质的反应；也会产生塌陷等现象。这些反应和现象都不再符合Arrhenius式。在这样的高温条件下做出的高温加速试验，对于推算正常贮存温度的有效期是没有意义的。 • 高温加速试验的温度必须低于物料的玻璃化转变温度Tg。对于含有部分玻璃态的冻干物料，如果其温度超过了玻璃化转变温度，黏度就会剧烈增大，固态的物料就会变成可变形的橡胶态。此时不再遵循Arrhenius式。对于玻璃化转变的动力学，应当应用William-Ferry-Landle 方程：