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第七章 细菌和病毒的遗传分析

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第七章 细菌和病毒的遗传分析 - PowerPoint PPT Presentation


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第七章 细菌和病毒的遗传分析. 重点:大肠杆菌的性别特性和重组 特征,中断杂交技术,细菌 重组作图的方法,噬菌体的 遗传分析。 难点:细菌的遗传分析和噬菌体的 遗传分析。. 第一节 细菌和病毒在遗传学研究中 的 地位. 一、细菌 二、病毒 三、细菌和病毒是遗传学研究的好材料. 一、细菌. 细菌的结构 细菌结构简单:其基本结构,包括细胞壁、细胞膜、染色体、核糖体、细胞质及内含物。特殊结构如荚膜和鞭毛。

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第七章 细菌和病毒的遗传分析

重点:大肠杆菌的性别特性和重组

特征,中断杂交技术,细菌

重组作图的方法,噬菌体的

遗传分析。

难点:细菌的遗传分析和噬菌体的

遗传分析。

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第一节细菌和病毒在遗传学研究中的地位

一、细菌

二、病毒

三、细菌和病毒是遗传学研究的好材料

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一、细菌
  • 细菌的结构

细菌结构简单:其基本结构,包括细胞壁、细胞膜、染色体、核糖体、细胞质及内含物。特殊结构如荚膜和鞭毛。

细菌染色体不凝缩,没有着丝粒,也没有纺锤体结构。细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链,没有组蛋白和其他蛋白质结合,也不形成核小体结构。

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研究细菌的方法

细菌的培养

基本培养基:仅能满足微生物野生型菌株

生长需要的培养基,称为基本培养基。

完全培养基:凡可满足一切营养缺陷型菌

株营养需要的天然或者半天然培养基

,称为完全培养基。一般可在基本培

养基中加入富含氨基酸,维生素和碱

基之类的天然物质配制而成。

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细菌能在固体培养基上生长:

(a) (b)

(c) (d)

图 细菌能生长在固体培养基上并显示不同的

表型

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细菌的基因组

细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链,没有组蛋白和其他蛋白质结合,也不形成核小体结构。

图裂开的E.coli细胞释放出它的染色体(电镜照片)

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除了含有一条染色体外,大部分细菌还含有小的环状的DNA分子(质粒)。质粒的复制独立于细菌染色体。

图 淋球菌的刚复制完成的质粒

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大肠杆菌的突变型

1)合成代谢功能的突变型

野生型品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂有机物的功能,这称为合成代谢功能。这需要大量基因的表达,其中任何一个必需基因突变都会阻碍整个合成代谢功能的实现,这种突变型称为营养缺陷型。

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2)分解代谢功能的突变型

野生型品系能利用比葡萄糖复杂的不同碳源,因为它能使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类,也能将复杂分子,如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功能称为分解代谢功能。这也需要许多相关基因的表达,其中任何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。 这种突变型称为分解代谢功能的突变型。

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3)抗性突变型

细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗生素产生抗性,对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白,从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。抗链霉素突变型的核糖体30S亚基的S12蛋白不再和链霉素结合,因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下,进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。

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二、病毒
  • 病毒的形态结构

病毒由蛋白质外壳包裹的DNA或RNA组成。

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病毒的分类

通常按宿主类型病毒分为:

1)噬菌体(phage):

细菌病毒、真菌病毒

2)植物病毒(plant virus):

感染高等植物、藻类等真核生物的病毒

3)动物病毒:

昆虫病毒和脊椎动物病毒

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病毒的基因组

根据病毒基因组的结构、以及其转录mRNA、指导蛋白质合成与病毒复制表达的特点,基本上可以将其分成6种类型:

双链(ds)DNA病毒基因组

单链(ss) DNA病毒基因组

正链(+) RNA病毒基因组

负链(-) RNA病毒基因组

双链(ds) RNA病毒基因组

反转录病毒基因组

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噬菌体的增殖与突变型

噬菌体的增殖

1)烈性噬菌体的增殖:

感染宿主细胞后就进入裂解反应,使宿主细胞裂解。整个过程包括吸附􀂾侵入􀂾脱壳􀂾生物合成􀂾装配和释放。

slide21

2)温和噬菌体的增殖

其感染周期有两种途径:即裂解途径和溶源途径,分别称为裂解周期(lytic cycle)和溶源周期(lysogenic cycle)。

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噬菌体的宿主细胞为细菌,利用宿主

细胞的代谢机器来增殖。

图 噬菌体裂解细菌后形成的清晰噬菌斑

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噬菌体的突变型

1)条件致死突变型

温度敏感突变(temperature sensitive mutation,ts),野生型噬菌体能在很大的温度变化范围内感染宿主并进行繁殖,而热敏感突变型,通常在30℃(许可条件)感染宿主进行繁殖,但在40~42℃(限制条件)就是致死的,不能形成噬菌斑;而冷敏感突变型在较低温度下就致死。

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抑制因子敏感突变(suppressor sensitive mutation,sus),其实质是原来正常的密码子变成了终止密码子,因而翻译提前终止,不能形成有活性的蛋白质。带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因(suppressor,su+)(许可条件)的宿主菌时能产生子代,但在感染另一种没有抑制基因(su-)(限制条件)的宿主菌时,不能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。

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终止密码子不编码任何氨基酸,称为无义密码子(nonsense codon),是蛋白质合成的终止信号。这些密码子是琥珀型(amber )UAG、赭石型(ochre)UAA 和乳白型(opal )UGA。

slide30

这些sus突变型之所以在带有相应的抑制基因宿主中可产生后代,是因为翻译过程中,在终止密码子处插入一个特定的氨基酸,防止在终止密码子位置上提前终止。如琥珀突变就有许多种抑制基因,各插入某个氨基酸以防止提前终止(见表2)。这些sus突变型之所以在带有相应的抑制基因宿主中可产生后代,是因为翻译过程中,在终止密码子处插入一个特定的氨基酸,防止在终止密码子位置上提前终止。如琥珀突变就有许多种抑制基因,各插入某个氨基酸以防止提前终止(见表2)。

slide32

携带su+突变型的菌株实质是tRNA基因发生了突变,例如表2中的琥珀型抑制基因su3+在UAG密码子上插入了一个酪氨酸,这是因为tRNATyr基因的反密码子的一个突变。携带su+突变型的菌株实质是tRNA基因发生了突变,例如表2中的琥珀型抑制基因su3+在UAG密码子上插入了一个酪氨酸,这是因为tRNATyr基因的反密码子的一个突变。

slide33

例如酪氨酸密码子是UAC,酪氨酸tRNA反密码子是AUG。置换突变使UAC变为无义密码子UAG后翻译便到此停止。如果酪氨酸tRNA基因发生突变而使它的反密码子由AUG变为AUC,这一反密码子便能识别无义密码子UAG,可是它的3′端上仍然携带着酪氨酸。因此这一突变型tRNA能使无义突变密码子位置上照常出现酪氨酸而使翻译正常进行。

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2)噬菌斑形态和宿主范围的突变型

噬菌斑形态突变型:突变后有的是由于侵染宿主细胞后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑(plaque)。另一些则是由于被感染细菌全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。

slide35

宿主范围的突变型:噬菌体感染细菌时,首先吸附于细胞表面的专一受体上,这是由受体的基因控制的,如果受体发生改变,有可能使噬菌体不能附着,从而该噬菌体的宿主范围就缩小,另外,噬菌体突变也可以扩大寄生范围。宿主范围的突变型:噬菌体感染细菌时,首先吸附于细胞表面的专一受体上,这是由受体的基因控制的,如果受体发生改变,有可能使噬菌体不能附着,从而该噬菌体的宿主范围就缩小,另外,噬菌体突变也可以扩大寄生范围。

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三、细菌和病毒是遗传学研究的好材料

使用细菌和病毒进行遗传学研究的优点:

1)繁殖快;

2)能产生大量子代;3)单倍体基因组使得所有突变能直接表达;

4)无性繁殖简化了遗传纯合菌株的分离;

5)培养方便,所需空间小;

6)基因组小;

7)基因的分离和操作方便;

8)能通过遗传修饰获得有经济价值的物质。

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第二节细菌的遗传分析

一、接合

二、F因子

三、用中断杂交实验作连锁图

四、F’因子与性导

五、转导与作图

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细菌中,大肠杆菌(E.coli)是最为广泛的遗传学实验材料。

细菌的遗传重组可以通过三种途径来来实现:

1)接合(conjugation):通过供体与受体之间的接触而传递DNA。

2)转化(transformation):是指游离的细菌DNA片段被吸收到不同的细菌细胞内(受体)。

3)转导(transduction):是指一种细菌的DNA片段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。

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一、接合

经细菌细胞直接的接触,把一个细胞(供体)的遗传物质传递给另一个细胞(受体),从而实现遗传重组。

1)细菌经典的杂交实验

细菌的重组最初是在E.coli中发现的。1946年Lederberg & Tatum通过E.coliK12 菌株杂交实验首次证明E.coli的有性生殖和基因重组。

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不同营养缺陷型的大肠杆菌:

A菌株:Met-bio-thr+leu+,需加甲硫氨酸和生物素。

B菌株:Met+bio+thr-leu-,需加苏氨酸和亮氨酸。

A菌株和B菌株营养缺陷型,不能在基本培养上生长。

A菌株和B菌株混合培养在完全培养基上,几小时后离心,涂布在基本培养基上,长出原养型(Met+bio+thr+leu+)菌落。

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问题:

1)这种原养型细菌的出现不一定是基因型的改变,可能是培养上的互补,即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收呢?

2)另一种可能是一个品系的DNA片段逸出细胞后,携带着相应的基因进入另一个品系的细胞,因为这种转化作用而产生了上述的营养型?

slide43

1950年Davis的U型管实验

他用一个U型管,在底部用一块细菌过滤器隔开。U型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和B,使它们繁殖到饱和状态,同时在U型管的一端交替地吸和压,使两臂中的培养液充分混合,但细菌的两个品系的细胞却不会接触。在U型管中培养一些时间后,再从两端分别取细菌进行培养,没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。

slide44

结论:要有原养型细胞的形成,两个菌

株间的直接接触是必不可少的。

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Lederbery和Tatum认为两个亲本细菌在基因重组过程中起着同等作用:E.coli的性系统是同宗配合。

Hayes则证明:E.coli遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂的生物不同。例如:两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等,有些亲本基因的组合会在后代出现,有一些则不会出现,而且所有后代中出现的基因都是连锁的,因此,E.coli的有性过程应该是异宗配合的。

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1952年Hayes的细菌杂交实验

菌株A:met-thr+leu+thi+;

菌株B:met+thr-leu-thi-

菌株A(经链霉素处理,不能分裂)与菌株B混合,涂布在基本培养基上,有活下来的菌落;

菌株B(经链霉素处理,不能分裂)与菌株A混合,涂布在基本培养基上,没有活下来的菌落。

slide47

结论:

Hayes 认为E.coli遗传物质的重组不是交互进行的,而是一种单向转移的结果。其中品系A作为遗传物质的供体,品系B的细胞则是遗传物质的受体。当两个亲本细胞接触后,供体A的遗传物质进入受体B的细胞中,紧接着遗传重组现象就在受体品系B的细胞中发生。供体品系相当于雄性,受体品系则相当于雌性。

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二、F因子
  • F因子

Hayes提出在E.coli两个品系间遗传物质的转移是通过一个Sex factor F(致育因子)介导进行的。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性,用F+表示。未携带F因子的菌株为受体菌或雌性,用F-表示。

现在已经证实F因子是一种质粒,大约包含100个基因。

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F因子的遗传结构

1)原点:转移的起点;

2)形成性伞毛的基因群:与结合有关;

3)DNA复制酶基因:与自我复制有关;

4)插入序列:与其插入细菌染色体的过程有关。

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在细菌接合过程中性伞毛连接F+和F-细胞。

slide51

根据F因子存在的方式,E.Coli 可以分为4种菌株:

F-菌株:不带有F因子的菌株,作为受体接受遗传物质。

F+菌株:带有F因子的菌株,作为供体提供遗传物质。

Hfr菌株:高频重组菌株,F因子通过配对交换,整合到细菌染色体上。

F’菌株:带有F’因子的菌株,既可转移供体的染色体片段又可转移F因子。

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三、用中断杂交实验作连锁图
  • 中断杂交实验法:(Wollman & Jacob,1950)

Hfr:thr+leu+azirtonrlac+gal+strs,

F-:thr-leu-azistonslac-gal-strr

将两菌株混合培养每隔一定时间取样

搅拌样品菌液,使配对的细菌分开

稀释菌液,防止再度配对 涂平板 重

组子菌落影印培养在若干不同的选择培养基上

根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图。

slide55

结果发现Hfr的未选择性标记基因进入F-所需时间:

分种 转移的Hfr基因

<9 0

9 azir

11 azirtonr

18 azirtonrLac+

25 azirtonrLac+gal+

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从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现开始,随着时间的推移,具有这一基因的菌落逐渐增加,直到某一百分数为止。基因出现的时间愈早,它所达到百分数也愈高。

上述四个基因在混合后24分钟内,以一定的顺序和时间间隔,先后从Hfr进入

F-的细菌中去。

slide57

染色体从一端开始,这一端称为原点(origin)或O,以线性方式进入F-细胞中,基因离开原点越远,进入F-细胞越迟。根据中断杂交技术,用杂交后Hfr基因最初在受体细菌中出现的时间作为指标,可以作连锁图。这里距离的单位是分钟,如ton在azi开始进入F-细胞后2分钟进入,那么azi和ton相隔2单位。

0 5 10 15 20 25

azi ton Lac gal

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如果让Hfr×F-杂交继续进行,长达二小时然后使之中断,发现某些F-受体转变为Hfr。这说明Hrf的全部基因已转移完毕,排在最后的F因子最后转移到受体,使它成为供体,但效率很低,是线性染色体的最后一个单位,我们可得下图:

0 azi ton Lac gal F

slide59

大肠杆菌的染色体呈环形

Wollman和Jocob用不同的Hfr菌株进行中断杂交试验,都可作成连锁图,可是基因转移的顺序、转移起点和转移方向都很不相同:

Hfr HO thr pro lac pur gal his gly thi F

1 O thr thi gly his gal pur lac pro F

2 O pro thr thi gly his gal pur lac F

3 O pur lac pro thr thi gly his gal F

AB312 O thi thr pro lac pur gal his gly F

slide60

规律:

任一行中任何一对相邻的基因在其他各行中也是相邻的。例如:his基因总是一边为gal,另一边为gly。每个Hfr菌系

的基因排列顺序都是相同的,所不同的是O点的位置都有改变,基因转移的方向不尽相同,致育因子(F)最后转移。

slide61

结论:

1)F因子的插入方向将决定Hfr染色体的极性;

2)插入F因子的一端将是原点,从原点Hfr染色体的转移开始;在F因子的另一端为终止点可能并不被转移,除非整条染色体都被转移。

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重组作图法

1)适用范围:在中断杂交试验中,根据基因转移的先后次序,以时间为单位求出各基因间的距离--时间单位法。两基因转移时间间距小于2分钟时,中断杂交法的图距不精确,应采用传统的重组作图法。

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2)原理

如果两基因紧密连锁,那么在知道这两个基因转移的先后顺序的前提下,后转移进去的基因发生了重组,那么先转移进去的基因一定也已经转移进去。在此基础上,用选择性培养基进一步挑选重组子中的重组子。

slide64

3) Hfr:lac+ade+Strs

F-:lac-ade-Strr

混合培养 用含有Str的基本培养基挑出ade+Strs 重组子 再用EMB培养基区分lac+和lac-

注:在含有链霉素的基本培养基上,Hfr细菌被杀死,因其为strs。未杂交的F-也死亡,因为是ade-。所以选出来的重组子都是ade+strr。

slide65

因为ade+是在Lac+之后进F-细胞,所以我们选出的F-:ade+strr一定是由同时得到Lac+和ade+的部分二倍体起源的。

lac+ ade+

lac- ade- 外基因子

内基因子

slide66

F-:ade+lac+,则说明未发生交换,为重组子中的亲组合。 lac+ade+ Strs

lac- ade- Strr

lac+ade+ Strr

slide67

F-:ade+lac-,则说明基因间发生交换,为重组子中的重组子。F-:ade+lac-,则说明基因间发生交换,为重组子中的重组子。

lac+ ade+ Strs

lac- ade- Strr

lac- ade+Strr

slide68

重组值计算

lac-ade之间的图距为:

(Lac-ade+) (Lac-ade+)

(lac+ade+)+(lac-ade+) ade+

注:

选择在腺甘酸缺乏的培养基上生长的类型。它们表明ade基因已转入细胞。

选出的lac-ade+类型即是重组子,而lac-ade+表型就是lac和ade发生交换的结果。可用此来计算重组值。

slide69
四、F’因子与性导

F'因子:能使Hfr转变为F+,F'因子

能整合,能切离,是带有部分细

菌染色体的F因子。

性导:利用F'因子形成部分二倍体

,叫做性导。

slide71
五、转导与作图

转导:是指以噬菌体为媒介将供体细菌

DNA导入到受体细菌并发生遗传重

组的过程。

普遍性转导:供体细菌染色体的任何部

分都可以组装到转导颗粒中,从而

可以转移到受体细菌中。

特异性转导:温和噬菌体进行的转导,

只能转导部分基因。

slide72

普遍性转导与作图

共转导:两个基因同时被包装到一个转

导颗粒,从而一起重组到受体细菌

的染色体上。

共转导的频率愈高,表明两个基因在染色体上的距离愈近,连锁愈密切;相反如果两个基因的共转导很低,说明其距离较远。因此,测定两基因的共转导频率就可以确定基因之间的次序和距离。

slide73

二因子作图

供体 受体 共转导频率

a+b+ ab 30% ab近

a+c+ ac 35% ac近,a在bc之间

b+c+ bc 3% bc远

slide74

三因子作图

例如:供体的基因型为a+b+c+,受体的基因型a-b-c-,在一个三因子转导杂交实验中,将产生各种不同的转导体。由于两个基因(a+b+或b+c+)共转导的机率和它们之间的距离成反比。即二基因距离愈近就愈可能被包装到同一个转导子中并共同转移到同一个受体细胞中,形成一个共转导子a+b+。

slide75

例:用E.coli:trpA+supC+pyrF+供体细胞和trpA-supC-pyrF-作为受体,由P1噬菌体进行三因子转导杂交实验,结果:

转导型 数目

supC+trpA+pyrF+ 36

supC+trpA+pyrF- 114

supC+trpA-pyrF+ 0

supC+trpA-pyrF- 453

问:它们的基因顺序?共转导频率?

slide76

解:上述三个基因在遗传图上的顺序可以从第3种转导型上立即判断出来,因为它的数目最少(等于0)。三个基因的次序为supC trpA pyrF。

supC+和trpA+二基因共转导形成第1和第2两种转导型,因此supC和trpA的共转导频率是:36+114 / 603=0.25。同理,supC和pyrF的共转导频率36/603=0.06。

共转导频率愈高说明两基因靠得愈紧,反之则愈远。

slide77
第三节 噬菌体的遗传分析

一、T2 突变型的两点测交与作图

二、λ噬菌体的基因重组与作图

slide78
一、T2 突变型的两点测交与作图

T2品系噬菌体两个特定性状:

噬菌斑的形态(r-或r+)

宿主范围(h-或h+)

h-r+:能侵染E.coli B和E.coli B/2,且有溶

菌阻碍现象(噬菌斑小,透明,

周边有光环)。

h+r-:只能侵染E.coli B,无溶菌阻碍现象

(噬菌斑大,半透明,周边清晰)。

slide79

r-:噬菌斑形态突变型,快速溶菌,产

生大的有明显界限的噬菌斑。

r+:噬菌斑形态为野生型,缓慢溶解产生

界限不清的小噬菌斑。

h+:能够溶裂E.coliB品系,不能溶解

E.coliB/2品系。

h-:宿主范围突变型,既能溶裂E.coliB

品系也能溶裂E.coliB/2品系。

slide80

h-r+、 h+r-混合感染E.coli B,子代噬菌体再感染E.coli B和E.coli B/2,得到四种噬菌斑(透明、小;半透明、大;半透明、小;透明、大)。子代的基因型分别为h-r+、h+r-、h+r+、h-r-。

slide81

不同速溶性噬菌体的突变在表型上

不同,可分别写成ra-、rb-、rc-等,用

h+rx-×h-rx+获得的试验结果如下:

slide83

每一杂交得到一连锁图:

ra 24.0 h

rb12.3 h

rc 1.6 h

slide84

三种不同的重组值,表示三个r基因的座位是不同的,所以有4种可能的连锁图:

ra rb rch

ra rbh rc

ra rc h rb

rah rc rb

slide85

确定四个基因的排列顺序时,首先只考虑rb,rc和h,进行rc-rb+×rc+rb-的杂交,得到的重组值与rb-h间的距离进行比较,若rc-rb>12.3=rb-h,则h位于中间,即排列顺序为rc-h-rb。

剩下的是ra在h的哪一边?答案是ra-rc-h-rb和rc-h-rb-ra都正确,因为T2噬菌体的连锁图也是环状的。

slide86

h

rc

rb

ra

图 T2的连锁图,只注明4个基因

slide87
二、λ噬菌体的基因重组与作图

Kaiser在1955年最早进行了λ噬菌体的重组作图试验。他用紫外线照射处理得到5个λ噬菌体的突变系:

s 系:产生小噬菌斑

mi系:产生微小噬菌斑

c 系:产生完全清亮的噬菌斑

co1系:产生除中央一个环之外其余部分都清亮的噬菌斑

co2系:产生比co1更浓密的中央环噬菌斑。

slide88

Kaiser用s co1 mi×+++杂交,后代有8种类型。病毒是单倍体,与二倍体生物不同,亲本组合与重组交换的组合可直接从后代中反映出来。8个类型中数目最少的两种类型就是双交换的结果,频率最高的两种是亲本类型,其余的为单交换类型。

slide90

从双交换的类型可知,这3个基因的次序就是s-co1-mi。s与co1的图距应为3.83cM;co1 与mi之间则为6.21cM;因为有双交换的存在,s与mi之间的图距则为8.32+2×0.86=10.04(cM)。

3个基因的遗传图:

s co1 mi

3.83 6.21