分离与分析技术

1. 分离与分析技术 • 色谱法是一种分离技术。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 • 其中的一相固定不动，称为固定相； • 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 气相色谱：流动相为气体（称为载气）；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱 液相色谱：流动相为液体（称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。

2. 气相色谱法的特点 （1）分离效率高： 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2） 灵敏度高： 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量. （3） 分析速度快： 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广： 适用于沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 不足之处： 不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。 被分离组分的定性较为困难。

3. 气相色谱流程 1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪； 1. 载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制; 2. 进样系统：进样器及气化室； 3. 色谱柱：填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）； 4. 检测器：可连接各种检测器，以热导检测器或氢火焰检测器最为常见； 5. 记录系统：放大器、记录仪或数据处理仪； 6. 温度控制系统：柱室、气化室的温度控制。

4. 高效液相色谱 高效液相色谱是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。他是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱理论，在技术上采用高压输压泵、梯度洗脱技术、新型高效填充剂及各种高灵敏度监测器。 高效液相色谱与气相色谱比较，可供选择的流动相种类较多，从有机溶剂到水溶剂，既能用纯溶剂又可用二元或多元混合溶剂，并可任意调配比例，通过改变溶剂极性或强度继而改变色谱柱效能、分离选择性和组分的容量因子，最后实现改善色谱系统分离度的目的。

5. 1. 分析速度快。 2. 分离效率高。 3. 灵敏度高、易于实现操作自动化。 4. 适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 高效液相色谱法的特点

6. 高效液相色谱仪流程示意图

7. 进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：

8. 紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。 最常用的检测器。

9. 定性方法： 1. 利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 2.利用文献保留值定性

10. 常用的几种定量方法 （1）归一化法：若试样中含有n个组分，且各组分均能洗出色谱峰，则其中某个组分的质量可按下式计算 • 特点及要求： • 归一化法简便、准确； • 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； • 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。

11. （2）内标法：在一定试样中加入一定量的内标物，根据待测组分和内标物的峰面积及物质量计算待测物质质量的方法。 内标物要满足以下要求： （1）试样中不含有该物质； （2）与被测组分性质比较接近； （3）不与试样发生化学反应； （4）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS 计算式：

12. 内标法特点 (1)内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。 (2)每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 (3)若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：

13. （3）外标法 外标法也称为标准曲线法。 • 特点及要求： • 外标法不使用校正因子，准确性较高; • 操作条件变化对结果准确性影响较大; • 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。

14. 苯、甲苯、乙苯混合物的分离和定量分析 • 掌握气相色谱法分离多组分混合物的方法。 • 练习用归一化法定量测定混合物中各组分的含量。 实验目的

15. 实验原理 混合物的分离与定量分析涉及到色谱峰的确定和定量方式的选择两个方面。前者属于色谱定性分析。后者为定量分析。 在确定的实验条件下，每种物质都有一定的保留时间，因此，在相同的实验条件下，分别测定纯物质和样品各组分的保留值，将两者进行对比，就可确定各组分的种类。（保留值定性） 但该法要求严格的色谱条件，操作条件的变化容易产生误差，通常采用相对保留时间来定性。

16. 定量方法： 归一化法：若试样中含有n个组分，且各组分均能洗出色谱峰，则其中某个组分的质量可按下式计算。

17. 了解气相色谱仪的基本结构及操作步骤。 掌握利用归一化法分析混合物中各组分含量的方法。 实验预习

18. 1. 色谱仪: 气相色谱仪，热导池检测器，微量注射器（10mL） 2. 色谱柱：2 m×5 mm 3. 固定相: 15%邻苯二甲酸二壬酯；102白色担体60~80目，载气：氮气 4. 苯、甲苯、乙苯。 三组分混合标准溶液：苯、甲苯、乙苯 重量比为：1：1：2。三组分混合样品。 仪器与试剂

19. 基本操作 1. 打开电脑主机，再打开气相色谱的模块，启动工作站并初始化仪器。 2. 开机调试，按下列参考色谱条件将仪器调至所需工作状态。 气化室温度：柱温：100 接口温度： 检测器温度： 桥流：120mA 载气：氮气，流速=40 mL/min， 纸速：1cm/min，5 cm/min 衰减：自选 3. 运行程序，清洗色谱柱，直至基线平稳，然后进样，进行测定。 4. 测定结束后，依次用纯水、100%甲醇洗涤20分钟，退出主程序，关闭计算机。

20. 实验步骤 • 定性分析： • 仪器稳定后，调纸速为1cm/min，用10mL注射器进2.0mL混合样品和5mL空气，记录色谱图（I）。 • 在完全相同的条件下，分别进苯、甲苯、乙苯等纯试剂，每次进样0.50~1.0mL试剂和5.0mL空气，记录色谱图（II）。 • 测定校正因子 纸速为5 cm/min，进2.0mL三组分混合标准试剂和5.0mL空气，记录色谱图（III）。 • 混合物的定量测定纸速为5 cm/min，进2.0mL三组分混合样品和5.0mL空气，记录色谱图（IV）。

21. 数据处理 1. 准确测量色谱图I~IV各峰的保留时间tR和死时间t0,比较个纯是基于混合物中各峰的保留值，确定各峰是什么物质。 2. 计算甲苯和乙苯的校正保留时间和对苯的保留值。 3. 测量各峰的峰面积，以苯为标准，求出其余两组分的相对重量校正因子（重量校正因子的文献值为：苯：0.780，甲苯：0.794，乙苯：0.818） 4. 采用归一化法求出混合物中各组分的百分含量。 相对校正因子 未知液中甲苯的含量

22. 注意事项和问题 • 进样量准确与否是否会影响归一化法的分析结果？ • 2. 能否从理论上揭示本实验的出峰顺序? • 3. 进样器要充分洗涤。

23. 反相色谱法测定有机化合物 中甲苯的含量 • 了解高效液相色谱仪的基本结构及基本操作。 • 了解反相色谱法的基本原理。 • 掌握利用内标法进行色谱定量分析的实验方法。 实验目的

24. 实验原理 流动相的极性大于固定相的化学键合相色谱称为反相色谱。由于各种物质的极性不同，因而在反相色谱体系中的分配能力不同，因此保留时间不同，在色谱图上呈现不同位置的色谱峰。反相色谱大部分以C18或C8为色谱柱，以甲醇或乙氰的水溶液为流动相。 采用内标法定量时，首先将一定量的待测物标准品溶液与内标物标准品溶液混合，进行色谱分离，测得峰面积分别为Ai和As，求出相对校正因子f΄。 样品分析时，将一定量的内标物加入待测样品中，进行色谱分析，测得峰面积，计算样品中待测物的量。

25. 了解高效液相色谱仪的基本结构及操作步骤。 掌握利用内标法分析混合物中甲苯含量的方法。 实验预习

26. 1. 色谱仪: Agilent 1100 2. 色谱柱：C18柱， 250 mm×4.6 mm 3. 流动相: 甲醇:水(70:30)，流速: 1.0 mL/min 4. 检测器: 紫外检测器 254 nm 仪器与试剂

27. 基本操作 1. 打开电脑主机，再打开高效液相色谱的模块，启动工作站并初始化仪器。 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：流动相组成=甲醇:水(70:30)，流速=1.0 mL/min，柱压=200 kPa。 3. 运行程序，清洗色谱柱，直至基线平稳，然后进样，进行测定。 4. 测定结束后，依次用纯水、100%甲醇洗涤20分钟，退出主程序，关闭计算机。

28. 实验步骤 1. 确定实验条件（流动相、流速、检测波长等） 2. 溶液的配制： （1）内标物溶液的配制：准确称取一定量苯酚纯品，加甲醇溶解后制成0.400 mg/mL的标准溶液 （2）甲苯标准溶液的制备：准确量取一定量甲苯的标准品，加甲醇溶解后制成0.500 mg/mL的标准溶液 （3）样品溶液的制备：准确称取适量样品，加甲醇超声溶解，定容于100 mL容量瓶中，过滤备用。

29. 3.相对校正因子的测定： 取1.00 mL甲苯标准溶液和1.00 mL苯酚标准溶液混合，待仪器稳定后，注入10цL混合溶液，记录色谱图，平行测定三次。 4. 样品分析： 取1.00 mL内标标准溶液和1.00 mL样品溶液混合，待仪器稳定后，注入10цL混合溶液，记录色谱图，平行测定三次。

30. 数据处理 相对校正因子 未知液中甲苯的含量

31. 注意事项和问题 1. 检查流动相是否充足。 2. 待仪器稳定后，再进样。 3. 进样器要充分洗涤。