1 / 24

Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS

Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS. MVDr. Katarína Domaracká, PhD. MVDr. Monika Novikmecová MUDr. Iveta Fandáková MUDr. Zuzana Sz ö vényiová. Princíp : PCR - polymerázová reťazová reakcia.

gazit
Download Presentation

Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS MVDr. Katarína Domaracká, PhD. MVDr. Monika Novikmecová MUDr. Iveta Fandáková MUDr. Zuzana Szövényiová

  2. Princíp: PCR-polymerázová reťazová reakcia Polymerázová reťazová reakcia (PCR, polymerase chain reaction) umožňuje selektívne zmnoženie (amplifikáciu) určitej oblasti DNAspôsobom podobným in vivo DNA replikácii, pričom veľkosť amplifikovaného úseku ohraničujú dva oligonukleotidy – primery. (1985, Kary Mullis)

  3. Cieľová dvojvláknová DNA Mechanizmus PCR reakcie Počiatočná denaturácia DNA 94-95°C, 5´ “Annealing” primerov 30-60°C, 30´´ Primery sú predĺžované prostredníctvom aktivity Taq polymerázy Nové reťazce 74°C, 2-5´ ´n´cykly sa opakujú Denaturácia DNA 95°C, 30´´

  4. VZORKA IZOLÁCIA DNA, RNA AMPLIFIKÁCIA DETEKCIA

  5. Využitie PCR v diagnostike infekčných ochorení baktérie Bordettella pertusis, Borrelia burgdorferi, Mycoplasma sp., Chlamydia sp., Ureaplasma sp., Neisseria gonorhoeae, Mycobacterium sp........ vírusy CMV, HSV, EBV, rotavírusy, adenovírusy papilomavírusy, hepatitída B a C... fungi faktory virulencie, gény rezistencie

  6. CSFako vzorka pre PCR • jedna z najúspešnejších aplikácií PCR pri diagnostike infekcií CNS • PCR- ideálna pre dg. ťažko kultivovateľných mikroorganizmov • možnosť pozitívneho nálezu aj po aplikácii nízkych dávok antivirotík (inhibujú tradičné kultivácie) • časová výhoda oproti sérologii (tvorbaprotilátok trvá 2-4 týždne), PCR zachytí vírus v čase najvyššej replikácie

  7. Senzitivita PCR v CSF • nízka senzitivita (falošná negativita) príčiny: - nízka hladina vírusu vo vzorke - „clearance“- silné neutralizujúce protilátky - inhibítory = produkty rozpadu erytrocytov !PCR neovplyvňuje xantochrómia, vysoká hladina bielkovín a leukocytov !!!

  8. Špecificita PCR v CSF • pozitívny výsledok indikuje prítomnosť nukleovej kyseliny vírusu (súčasná alebo pretrvávajúca vírusová infekcia) • Výnimky! (pozitívny výsledok neindikuje vírusovú infekciu – falošná pozitivita) - porušenie hematoencefalickej bariéry (bakteriálna meningitída, kontaminácia krvou) - prítomnosť infikovaných Leu (CMV)

  9. Diagnostika herpesvírusových infekcií CNS !Zlatý štandard pre diagnostiku herpesvírusových infekcií CNS! (DeBiasi a kol, 2004) problém: pretrvávanie latentných herpesvírusov u zdravej populácie (ich genóm je cieľ pre PCR) !Dôležité zvážiť výskyt pozitívneho nálezu!

  10. Herpes simplex vírus 1 a 2 • HSV1 aj HSV 2 – najčastejšia komplikácia postihnutie CNS • HSV1 – najčastejšia endemická encephalitis v rozvinutých krajinách • pozitívny PCR výsledok pre HSV (1/2) korešponduje vždy s klinickým obrazom a je „gold standard“ pre diagnózu, s približne 96% senzitivitou a 99% špecificitou (Boivin a kol. , 2004)

  11. Kinetika HSV pozitivity v CSF • prvotné štúdie – pozitívny výsledok hneď po infekcii • novšie - 3 z 11 pac. negatívny výsledok počas prvých 72 h • nevhodné hodnotiť negatívny výsledok počas prvých 72 hodín, PCR test má byť opakovaný na 4 až 7 deň po objavení symptómov • nevhodné prerušiť terapiu antivirotikami na základe negatívneho výsledku do 72 hod. (Weil a kol, 2002) • u pacientov so symptómami viac ako jeden až dva týždne simultánne PCR a sérologia

  12. Vplyv terapie na PCR pozitivitu HSV v CSF • Lakemann a kol. dĺžka antivirot. terapie: - 1 týždeň – žiaden vplyv na pozitivitu - 8-14 dní - 47% pozitivita - viac ako 2 týždne - 21% pozitivita • ak je PCR pozitívna 10 až 14 dní po ukončení terapie acyklovirom – ďalšia terapia (Cinque a kol. 2002)

  13. PCR diagnostika CMV • kvalitatívna : latentní nosiči • moč,krv + EDTA (!nie citrát ani heparín!),CSF • plodová voda, punktáty, BAL, stery oko, sliny !Problém: odlíšiť latentnú a akútnu infekciu na základe PCR diagnózy! • kvantitatívna PCR (real-time PCR) • monitoruje fluorescenciu emitovanú počas reakcie ako indikátor produkcie amplikónov v každom PCR cykle (v reálnom čase) • umožňuje kvantifikovať hladinu virémie v krvi, čím nepriamo monitoruje účinnosť terapie

  14. EBV • hodnotenie pozitívneho PCR výsledku EBV v CSF je stále nejasné • DNA EBV je často detekovaná aj pri absencii neurologických porúch • Výnimka! AIDS - associated primary CNS lymfoma (citlivosť 83-100 %) (špecificita 88-100%) (Boivin a kol. 2004)

  15. CSF- manipulácia a odosielanie • pre analýzu potrebné minimálne množstvá CSL, senzitivita závislá na objeme vzorky • 200 - 300 ul – ideálne množstvo • optimálne - čerstvé vzorky doručené čo najrýchlejšie po odbere! • krátkodobé skladovanie -20°C, (1-2 dni)

  16. Pomocou metódy PCR vyšetrujeme aj nasledujúce patogény: • Chlamydia trachomatis • Ureaplazma urealyticum + parvum • Mycoplasma spp. (Mge+Mho+Mpn+Mfe+Mpe) • HPV „high risk“ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45) • Neiseria gonorhoeae • Pneumocystis jiroveci (pôv. carinii, 4. porcia BAL)

  17. Lymská borelióza (LB) • Borrelia burgdorferi sensu stricto (USA) • Borrelia garini • Borrelia afzelii • rád Spirochaetales gramnegatívne,špirálovité mikroaerofilné ťažkokultivovateľné baktérie • antropozoonóza (kliešte, lietajúci a savý hmyz) • unikátna baktéria z mikrobiologického aj z molekulárneho hľadiska (najviac plazmidov), umožňuje jej prežiť v prostredí bezstavovcov aj stavovcov Európa – B. senzu lato

  18. Nepriama - sérologická diagnostika 1. stupeň (IF, ELISA)detekciaIgM a IgG protilátok - ELISA IV generácia, obsahuje VslE atg príp. jeho konzervatívnu doménu C6 - v ojedinelých prípadoch pozorujeme skríženú reaktivitu s EBV, iné herpetické alebo spirochétové infekcie 2. stupeň IMUNO BLOT ( Western blot) - konfirmácia špecificity protilátok !!!! - v prípade nepriekaznej klinickej symtomatológie a pozitivity protilátok v sérologických reakciách

  19. western blot-v prípade nepriekaznej klinickej symtomatológie a pozitivity protilátok v sérologických reakciách Antigén p100 p58 BmpA VlsE OspC p41i DbpA - IgM - OspC - tvorí sa po vniknutí do organizmu Bičíkové proteíny (flagelín p41) - IgG - VslE – lipoproteín,zodpovedá za únik pred imunitou má kozervatívnu doménu C6 DbpA (Osp17, p18), DbpB OspA + OspB - povrchové proteíny ktoré borélia tvorí aby unikla imunite kliešťa, prípadne imunite hostiteľa Obr. IgG imunoblot pacientov s neuroboreliózou (Wilske a kol.2007)

  20. LB-priama diagnostika • PCR –plazmidová, chromozomálna DNA • biopsia kože, moč – - v štádiách EM (erytema migrans) a ACA (acrodermatitis chronica atroficans) - vysoká senzitivita • synoviálna tekutina – vysoká senzitivita • CSF -odporúča sa vo včasných štádiách LNB - najvyšší záchyt DNA borelií je do 6týždňov od výskytu prvých symptómov ochorenia - v neskorších štádiách neuroboreliózy senzitivita metódy klesá (EFSN guidelines, 2010) !!!!!!PRE PCR DIAGNOSTIKU LB SA NEODPORÚČA POUŽIŤ KRV ANI SÉRUM!!!!!!!

  21. Výhody PCR v diagnostike infekčných ochorení • vysoká senzitivita (1-10 baktérií 10-100 PFU/vzorka) • vysoká špecificita (daná sekvenciou primerov) • minimálne množstvo vzorky (výnimka moč) • detekcia perzistentných infekcií, asymtomatických infekcií • detekcia ťažko kultivovateľných mikroorganizmov • rýchlosť

  22. Nevýhody PCR • INTERPRETÁCIA • informácia len o kvalite (!výnimka kvantitatívna PCR!) !to znamená DNA je, alebo nie je vo vzorke prítomná! neinformuje o: - imunitnej odpovedi organizmu - citlivosti na antibiotiká • detekuje aj prítomnosť mŕtvych mikroorganizmov vo vzorke (Chlamydia trachomatis viac ako 3 týždne po ukončení liečby doxycyklínom, Bauwens a kol. 1993) • vysokériziko kontaminácie pri odbere a spracovaní vzorky • prítomnosť inhibítorov vo vzorke (talk, heparín...), falošne negatívne výsledky (duplicita odberu) • finančná a technologická náročnosť

  23. avilab@avilab.sk Adresa: Rastislavova 43 Košice Tel. kontakt: 055 / 615 23 74 615 23 75 615 23 76

More Related