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PCR 及分子标记. 资料来源:丁香园. PCR ( P olymerase C hain R eaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. P eoples C hoice R eaction. The PCR cycle. 95℃ step to denature the duplex DNA,

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Presentation Transcript
slide1

PCR 及分子标记

资料来源:丁香园

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PCR(Polymerase Chain Reaction)

Three steps: denaturation,

primer annealing,

polymerization.

Peoples Choice Reaction

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the pcr cycle
The PCR cycle
  • 95℃ step to denature the duplex DNA,
  • An annealing step of around 55℃ to allow the primers to bind,
  • 72℃ polymerization step.
  • Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme

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历史

60s-70s:基因的体外分离技术。

Khorana(1971):美国MIT教授、1968年诺贝

尔医学奖得主 “经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

核酸体外扩增最早设想遗忘:

当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物;

当时(1970)Smith等发现了内切酶,体外克隆基因成为可能

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Kary Mullis(1985)

发明过程

Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:

“这种简单得令人惊奇,可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下,即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。

发展过程:

开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段,该酶不耐热,每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。

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专利官司

1987年美国专利局专利授权

1989年,DuPont异议,大小公司对簿公堂,将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是,1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明,并公布于众,应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg(研究DNA聚合酶获诺贝尔奖)也认为,任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。

美国专利局驳回DuPont异议,地方法院判属Cetus

Cetus获胜后马上反诉,指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器

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PCR发展速度

惊人,没有一种技术能与之相比

引用论文最多、应用范围十分广泛

1993年度诺贝尔化学奖:Mullis,与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获

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原理

类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

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procedures
template(DNA or RNA),

primers,

Taq enzyme,

10×PCR buffer,

Mg++,

5mmol/L dNTPs

pre-denaturation--denature completely

Denaturation

annealing

Elongation

cycles:25-30

procedures

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Primer design

Most imp.

(1)length: 20~30bp

(2)G+C contents:ATCG random distributed

(3)primers : no complementary sequence

(4)3‘end of the primer: no modification

(5)5‘end of the primer:product length,can be modified

(6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base

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Primer designed with the help of computer

DNA database

conservative region comparision

primers or blast

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PCR reaction components and their functions

template:ssDNA, dsDNA

mRNA needed to be RT as cDNA

samples:from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques.

DNA:very stable

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primes

If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-ends of the primers.

Can amplify fragments over 10kb in length

Store:纯化引物在25%乙腈溶液中4℃;冻干引物于-20℃可保存1-2年,液体状态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃保存。

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buffer

10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃)。

Mg2+:forTaq polymerase activity

conc.:Low:low activity

high: non-specific amplification

dNTPs:

贮备dNTP液:1 mol/L NaOH 调pH至中性。

贮备浓度为5-10mmol/L,终浓度为20-200umol/L,分装-20℃保存。

4种dNTP浓度应相同。

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Taq DNA polymerase:

from thermophilic bacteria.

Taq polymerase from Thermus aquaticus.

other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.

mineral oil

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Selection for DNA polymerase

Klenow酶

早期采用

该酶不耐热,缺点有

①温度要求低(37℃),受热即失活;

②产物特异性不高;

③积累大量的失活残酶,使反应产物纯度大大降低;

④扩增的最长序列约400bp(Taq酶则能扩增10kb)

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thermostable DNA polymerases

①Taq DNA polymerase

②Tth DNA polymerase—from T.thermophilus

③VENT DNA polymerase—from T.litoralis

④Sac polymerase

⑤pfu polymerase

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taq dna
Taq DNA聚合酶
  • 分离:1969年,美国黄石国家公园温泉
  • 分子量:94KDa
  • 活性:在几种水生栖热菌中活性最高,200 000U/mg

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taq dna1
Taq DNA聚合酶

离子需要:对Mg2+、单价离子性质和浓度较

敏感。最适浓度为50mmol/L。

忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环,利用PCR克隆、测序时尤应注意。

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taq dna2
Taq DNA聚合酶

抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。

内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时,会在无模板对照管出现扩增带。

保存:在-20℃至少6个月。

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PCR optimization

变性温度和时间

92-95℃,富含G和C的序列,可适当提高,但过高或时间过长都会导致酶活性损失。

退火温度与时间

引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时,应提高温度。温度越高,产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。

延伸温度和时间

温度:72℃,接近Taq酶的最适75℃

时间:过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列,则可适当增加时间。

循环次数

循环过多,非特异性产物大量增加

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PCR污染及其对策

强大扩增能力+检测的敏感性

极微量的污染便可导致假阳性

污染源的追踪

①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等

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污染的预防

  • 隔离不同操作区
  • 分装试剂
  • 改进实验操作
  • 专用加样器
  • (5)结果的重演

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遗传性疾病

地中海贫血的基因诊断

血友病

苯丙酮尿症

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传染性疾病

肝炎

性病

肿瘤

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法医学

个人识别、亲子鉴定

1985年,英国遗传学家Jeffreys采用DNA

指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。

有时犯罪物证量很少,不足以用来进行DNA指纹分析,PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证,如一根毛发、一滴血等都可用于分析,在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。

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植物遗传育种

构建遗传图谱、分离目的基因、

基因定位

分子标记辅助育种

了解不同品种间的亲缘关系、系统进化

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畜 牧

畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测

性别鉴定:牛、绵羊Y染色体上特异

DNA片段

构建基因图谱

检测基因整合与表达:转基因鱼

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植物保护

杀虫病原微生物的基因型鉴定

植物病原微生物分类

形态学上相似性和潜在的血清学交互反应,用常规方法难以区分,采用反转录PCR(RT-PCR)可准确快速区分

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其他

①考古学

②植物分类学

③群体生态学

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Introduction

形态标记、细胞学标记、生化标记

数十种技术问世。

万变不离其宗:分子杂交、PCR扩增

第一类:电泳、分子杂交为核心

代表:RFLP、DNA指纹

第二类:电泳、PCR为核心

代表:RAPD、SSR、AFLP

第三类:DNA序列为核心

代表:ITS测序分析

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优点
  • 数量丰富、信息量大;
  • 与生长发育无关,取材不受限制;
  • 较多共显性,信息量完整
  • 在真核生物中,基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性,因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列,它们的变异不受或较少地受自然选择的制约

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applications
Applications
  • 种质资源研究
  • 品质纯度鉴定(包括DNA指纹鉴定)
  • 构建遗传连锁图
  • 基因定位(QTL)
  • 标记辅助选择
  • 比较基因组研究
  • 基因克隆(图位克隆)
  • 生物起源、进化、医学及法医学

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RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

by Botstein(1980)

基本原理:物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下,产生相当多的大小不等的片段,用放射性同位素标记的DNA作探针,把与被标记DNA相关的片段检测出来,从而构建出多态性图谱。

优点:共显性,非常稳定

缺点:检测步骤多,周期长,费时、费钱;

用作探针的DNA克隆制备、保存不方便;

放射性同位素

自从人的RFLP图谱构建后,又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。

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RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)

1990:

Williams(Du Pont):RAPD;

Welsh(Cal.Biology Inst.):AP-PCR(Arbitrary Primer-PCR)

=Random Primer-PCR

=Oligo Primer-PCR

=SODA(Small Oligo DNA Analysis)

Rapid and simple

Random primer:9-10bp

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与常规PCR的不同

A.引物长度短

常规PCR中需要两个引物,长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物,长度9-10个核苷酸,而且是随机引物。

B.退火温度低

RAPD引物短,因此退火温度要低,一般为35-37℃。

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通用性

--实验步骤少,省工、省力、进度快

--不需先知道基因组的任何分子信息

--所用材料不需有性世代,可用任何单一亲本、任何部位的材料,在没有有性世代的线粒体、叶绿体DNA研究中也可使用;

--引物没有严格的种属界限,同一套引物可用于任何一种植物的研究,具有广泛性和通用性。

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植物分子生物学中的应用

用于种属特异性鉴定

外源导入基因的追踪

遗传作图

RAPD标记从理论上讲是无限的,而且在端粒及重复顺序上可以找出RAPD标记位点,因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。

鉴定染色体上特异的DNA片段,进行基因定位和分离

RAPD易发现多态性,敏感性高。可找出与靶基因连锁的RAPD标记,进行基因定位。

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AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism)

瑞士Zabeau等1992年发明

结合了RFLP和PCR技术的特点,具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。

基本原理:对基因组DNA进行酶切,连上双链人工接头,根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物,进行选择性扩增。

它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合,再选用内切酶以达选择的目的。

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三个步骤

(1)DNA酶切及人工接头连接,对提取DNA质量要求较高,需避免其它DNA污染和抑制物质的存在;

(2) 扩增反应;

(3) 通常在4%-6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离

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特点

--理论上,可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多,所以标记数目是无限的。

--每次谱带在50-100条之间,多态性检测非常有用

--呈典型的孟德尔方式遗传

--可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。

--可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段,

—对模板浓度不敏感,即使模板浓度存在差异,也会得到强度一致的谱带。

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缺点

专利技术,试剂盒价格贵

需要同位素或非同位素标记引物,须具特殊防护措施、配套仪器设备

基因组的不完全酶切会影响实验结果,所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。

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SSR( Simple sequence Repeat )

=(microsatellite)

=(Short Tandem Repeat,STR)

Satellite DNA:真核生物基因组酶切、离心后,在 主带附近会出现(AT)含量很高的简单高度重复序列。

Microsatellite DNA:一类由几个核苷酸(一般1-5个,基序很短)为重复单位串联而成的DNA序列。

继RFLP之后的第二代分子标记

多态性好、重复好、共显性标记

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特点

微卫星DNA广泛存在:人和动物(TG)n,

植物(AT)n

微卫星DNA长度的多态性

微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列

原理

根据两端序列的保守性,设计引物;进行

PCR,电泳分离,染色显带以检测微卫星序

列多态性。

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applications

构建遗传连锁图

种质资源鉴定

标记辅助育种

基因诊断与治疗:一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关。

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其他
  • 简单序列重复区间(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)
  • 序列标记位点(Sequence-Tagged Sites,STS)
  • 小卫星DNA(Minisatellite DNA)
  • 单链构型多态性(Single-strand Comformation Polymorphism,SSCP)
  • 变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)

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