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亲 和 纯 化

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亲 和 纯 化. 亲 和 纯 化. 生物物质具有的识别特定物质并与该物质的分子发生特异性相互作用并结合的能力称为生物亲和作用 (bioaffinity) 或简称亲和作用 (affinity) ; 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术 (Affinity purification) 。. 生物亲和作用. 亲和作用的本质 影响亲和作用的因素 亲和作用体系. 亲和作用的本质. 亲和作用是自然界普遍存在的现象,只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性;

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Presentation Transcript
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亲 和 纯 化
  • 生物物质具有的识别特定物质并与该物质的分子发生特异性相互作用并结合的能力称为生物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用(affinity);
  • 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)。
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生物亲和作用
  • 亲和作用的本质
  • 影响亲和作用的因素
  • 亲和作用体系
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亲和作用的本质
  • 亲和作用是自然界普遍存在的现象,只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性;
  • 生物亲和作用是生命诞生、维持与延续的重要基础,而亲和纯化技术仅仅是人为利用生物亲和作用的手段之一。
  • 亲和作用的分子(物质)对可以是大分子—小分子,大分子—大分子,大分子—细胞,细胞—细胞。
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亲和作用的本质
  • 生物分子之间发生亲和结合作用的条件:
  • 具备“钥匙”和“锁孔”的空间构形关系;
  • 静电作用
  • 氢键
  • 疏水性相互作用
  • 配位键
  • 弱共价键
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影响亲和作用的因素
  • 离子强度
  • pH
  • 抑制氢键形成的物质
  • 温度
  • 离液阴离子
  • 螯合剂
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特异性

亲和体系

高特异性

群特异性

抗原-单克隆抗体

荷尔蒙-受体蛋白

核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白

酶—底物、产物、抑制剂

免疫球蛋白—A蛋白、G蛋白

酶—辅酶

凝集素—糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体

酶、蛋白质—肝素

酶、蛋白质—活性色素(染料)

酶、蛋白质—过渡金属离子(Cu2+,Zn2+等)

酶、蛋白质—氨基酸(组氨酸等)

亲和作用体系
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亲和作用体系
  • 将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联,可特异性吸附或结合另一种分子,使另一种分子(通称为目标产物)容易从混合物中得到选择性分离纯化;
  • 在亲和纯化中,一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象(一般为蛋白质)的配基(ligand)。
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L表示配基,E表示蛋白质,可逆性亲和结合作用可表示为:

其中,E·L为蛋白质与配基形成的复合体。上述结合反应的解离常数为:

结合常数为:

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亲和层析
  • 原理与操作
  • 亲和吸附介质
  • 亲和层析过程
  • 应用
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原理与操作
  • 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法;
  • 由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上,具有高度的选择性,因此,亲和层析操作与一般的固定床吸附操作方式相同,多采用断通式前端分析法。
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亲和吸附介质
  • 亲和配基
  • 亲和吸附介质
  • 间隔臂
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亲和配基
  • 酶的抑制剂
  • 抗体 :免疫亲和层析

(Immunoaffinity chromatography)

  • A蛋白(protein A)
  • 凝集素(lectin)
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亲和配基
  • 辅酶和磷酸腺苷
  • 三嗪类色素(triazine dyes):色素亲和层析

( Dye-ligand affinity chromatography)

  • 过渡金属离子 :金属螯合层析

(Metal chelate chromatography)

  • 组氨酸
  • 肝素(heparin)
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亲和吸附介质

亲和吸附介质又称亲和载体(affinity carrier)。作为载体的固体粒子应该满足以下要求:

  • 具有亲水性多孔结构,无非特异性吸附,比表面积大;
  • 物理和化学稳定性高,有较高的机械强度,使用寿命长;
  • 含有可活化的反应基团,用于亲和配基的固定化;
  • 粒径均一的球形粒子。
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亲和吸附介质

利用凝胶过滤介质合成所需的亲和吸附介质的合成方法:

  • 溴化腈活化法:用于多糖凝胶的活化,固定活性基团为氨基的配基(R—NH2);
  • 环氧基活化法 :用于多糖凝胶和表面为氨基的载体的活化,固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基;
  • 硅胶的活化 。
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间隔臂
  • 为了与生物大分子发生有效的亲和吸附作用,需要在配基与载体之间连接一个“间隔臂”(spacer),以增大配基与载体之间的距离,使其与生物大分子发生有效的亲和结合 ;
  • 由于间隔臂过长容易弯曲,使配基与载体之间的距离缩短,不能有效地与酶的亲和结合部位接触,减弱了与酶的亲和作用,因此引入间隔臂的长度是有一定限制的 。
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亲和层析过程
  • 吸附操作中首先要保证亲和吸附介质对目标产物有较高的亲和吸附作用和吸附容量,对杂质的非特异吸附要控制在最低水平;
  • 料液流速是影响层析柱效和分离速度的重要因素;
  • 目标产物在亲和吸附介质上的吸附平衡关系多用Freundlkh或Langmuir型等温式表达。
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杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。因此,为减小吸附操作中的非特异性吸附量,应注意:杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。因此,为减小吸附操作中的非特异性吸附量,应注意:

  • 所用缓冲液的离子强度要适当,缓冲液的pH值应使配基和目标产物与杂质的静电作用较小;
  • 使用高纯度的配基制备亲和吸附介质,提高亲和吸附介质自身的质量;
  • 在料液(以及后续的清洗液)中加入表面活性剂 ,提高目标产物纯度和回收率。
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亲和层析过程
  • 清洗操作的目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质;
  • 使用与吸附操作相同的缓冲液,必要时加入表面活性剂,保证目标产物的吸附和杂质的除去。
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亲和层析过程

目标产物的洗脱方法有两种:

  • 特异性洗脱是利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂,通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合,脱附目标产物;
  • 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用,是较多采用的洗脱方法。
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亲和膜
  • 亲和膜(Affinity membrane)利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质,是固定床亲和层析的变型 ;
  • 利用亲和膜的纯化方法称膜亲和层析。(Membrane- based affinity chromatography)
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亲和膜
  • 在微滤操作中,流体以对流的形式透过滤膜,与配基接触,大大降低了传质阻力,从而可在不影响亲和结合作用的前提下最大限度地提高操作速度;
  • 利用亲和膜的纯化过程不仅设备投资低,而且配基用量小,对于利用昂贵配基(如抗体)的分离体系无疑是非常有利的。
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亲和膜

亲和膜的纯化过程具有如下优点:

  • 传质阻力小,达到吸附平衡的时间短,配基利用率高;
  • 压降小,流速快,设备体积小,配基用量低。

亲和膜吸附也存在一些缺点:

  • 从分离效率的角度,因膜的厚度(柱高)很小,理论板数很低,吸附和清洗效率低;
  • 膜的污染和膜孔的堵塞使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降,也是必须解决的问题。
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亲和沉淀
  • 亲和沉淀(Affinity precipitation)是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术;
  • 根据亲和沉淀的机理不同,亲和沉淀分为两种,即一次作用亲和沉淀(primary-effect affinity precipitation)和二次作用亲和沉淀(secondary-effect affinity precipitation)。
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一次作用亲和沉淀
  • 水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基,前者称为双配基(bisligand),后者称为多配基(polyligand) ;
  • 双配基或多配基可与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质(multivalent protein)发生亲和交联,进而增大为较大的交联网络而沉淀 。
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二次作用亲和沉淀
  • 利用在物理场(如pH、离子强度、温度和添加金属金子等)改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基,制备亲和沉淀介质 ;
  • 亲和介质结合目标分子后,通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀。
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一次作用亲和沉淀虽然简单,但仅适用于多价、特别是4价以上的蛋白质,要求配基与目标分子的亲和结合常数较高,沉淀条件难于掌握,并且沉淀的目标分子与双配基的分离需要透析或凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具,实用上存在较大难度。亲和沉淀研究多集中于二次作用亲和沉淀法,其中主要是可逆沉淀性聚合物(亲和载体)的探索。一次作用亲和沉淀虽然简单,但仅适用于多价、特别是4价以上的蛋白质,要求配基与目标分子的亲和结合常数较高,沉淀条件难于掌握,并且沉淀的目标分子与双配基的分离需要透析或凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具,实用上存在较大难度。亲和沉淀研究多集中于二次作用亲和沉淀法,其中主要是可逆沉淀性聚合物(亲和载体)的探索。
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亲和沉淀纯化技术具有如下优点:
  • 配基与目标分子的亲和结合作用在自由溶液中进行,无扩散传质阻力,亲和结合速度快;
  • 亲和配基裸露在溶液之中,可更有效的结合目标分子,即亲和沉淀的配基利用高;
  • 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀,易于规模放大;
  • 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物的纯化,可在分离操作的较初期采用,有利于减少分离操作步骤,降低成本。同时,在分离过程的早期阶段除去对目标产物有害的杂质,有利于提高目标产品质量和收率。
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亲和错流过滤
  • 亲和错流过滤(Affinity cross-flow filtration,ACFF)又称亲和过滤(Affinity filtration) ,是生物亲和相互作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术;
  • 亲和过滤法充分利用生物亲和作用选择性高的优点,利用可被膜完全截留的水溶性高分子化合物或不溶性微粒为载体固定亲和配基,亲和吸附目标分子,从而增大目标分子与杂蛋白分子的尺寸差别,大大提高膜分离的选择性,使目标分子的纯化程度接近或达到亲和层析的水平。
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亲和错流过滤
  • 亲和过滤操作包括进料(吸附),杂蛋白清洗和目标蛋白洗脱步骤,之后还要进行亲和载体的再生,以便下一批料液的分离纯化;
  • 分离过程可使用中空纤维膜等膜组件,提高过滤膜设备的比表面积。
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亲和错流过滤

亲和过滤将亲和吸附与膜分离结合,因此兼备亲和吸附和膜分离的优点:

  • 分离以压差为传质推动力,速度快,易于放大和实现连续化操作;
  • 亲和载体的引入提高了膜分离的选择性,使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析;
  • 制备亲和过滤介质所用的载体为水溶性聚合物或无孔微粒,无内扩散传质阻力,目标分子的亲和结合速度快,从而可最大程度地发挥膜分离法速度快的优势;
  • 可使用传统的亲和吸附介质,不需更用高压设备,可弥补高效亲和层析设备昂贵、放大困难的缺点。
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亲和双水相分配
  • 利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取,可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相(上相)的分配,提高目标产物的分配系数和选择性。这就是亲和萃取,又称亲和分配(Affinity partitioning) ;
  • 亲和分配纯化过程可经过三步操作完成,即亲和分配(进料),杂蛋白质反萃取(清洗)和目标产物反萃取(洗脱)。
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亲和反胶团萃取
  • 亲和反胶团萃取(Affinity-based reversed micellar extraction)是指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外,添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂(cosurfactant),通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用,促进目标产物在反胶团相的分配,提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性;
  • 亲和助表面活性剂的配基和疏水链长度是影响亲和反胶团萃取的重要因素。
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亲和反胶团萃取
  • 通过添加亲和助表面活性剂可使目标产物的萃取pH范围增宽,不仅可以提高目标产物的分配系数(收率),而且由于萃取操作的pH范围较宽,便于通过调节pH值提高萃取分离的选择性;
  • 亲和反胶团萃取的目标产物可通过调节水相pH和盐浓度进行反萃取。