1 / 25

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

生物化学实验 CQMU. 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳. P、74 生物化学与分子生物学实验室 2008.09. 一 实验目的 二 实验原理 三 实验材料与仪器 四 实验步骤 五 注意事项 六 思考题. 一 、 实验目的. 学习掌握电泳技术的基本原理 熟悉醋酸纤维薄膜电泳法分离血清 蛋白质的方法 了解血清蛋白质测定的临床意义. 二、电泳法的基本原理. 带电质点在电场中向所带电荷相反方向泳行的现象叫 电泳 （ Electrophoresis） 。

garan
Download Presentation

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 生物化学实验 CQMU 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 P、74 生物化学与分子生物学实验室 2008.09

  2. 一 实验目的 • 二 实验原理 • 三 实验材料与仪器 • 四 实验步骤 • 五 注意事项 • 六 思考题

  3. 一 、 实验目的 • 学习掌握电泳技术的基本原理 • 熟悉醋酸纤维薄膜电泳法分离血清 • 蛋白质的方法 • 了解血清蛋白质测定的临床意义

  4. 二、电泳法的基本原理 带电质点在电场中向所带电荷相反方向泳行的现象叫电泳（Electrophoresis）。 蛋白质是兼性离子，由于不同蛋白质分子的氨基酸种类和数目组成不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同，故在同一pH条件下，它们的电泳速度各不相同，因此可以彼此分开。

  5. H＋ COOH COOH COO－ P P P COO－ P NH2 NH2 NH3＋ NH3＋ OH－ OH－ H＋ 蛋白质两性电离和等电点 pH﹤pI 带负电,向正极移 pH=pI 不显电性 不移动 pH﹥pI 带负电,向正极移

  6. 血清蛋白电泳的基本原理 本实验以醋酸纤薄膜为支持物，利用血清蛋白质的等电点都低于8，在pH8.6的巴比妥缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动，经50分钟电泳后，用氨基黑10B染色，可将血清蛋白分为清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五个区带。

  7. 电泳仪 电泳槽 三、实验材料与仪器 1 器材： 血清、 醋酸纤维薄膜(8X2mm)； 常压电泳仪；水平电泳槽； 分光光度计等 分光光度计

  8. 2 试剂： （1）pH8.6巴比妥缓冲液(离子强度0.07) （2）0.5%氨基黑10B染色液 （3）漂洗液:乙醇:冰醋酸:H2O =45:5:40ml （4）洗脱液：0.4 mol/L NaOH溶液

  9. 四、实验步骤 • （一）准备： • 取缓冲液中浸泡的薄膜1张； • 用滤纸吸干多余水分； • 识别无光泽面； • 记下上样端的编号。

  10. 1.5cm （+） （-） 无光泽面 点样线 （二）点样： 用X光片蘸血清点于薄膜条无光泽面的点样线上（距膜端1.5厘米处），使血清渗入膜内。

  11. (三) 电泳： • 将薄膜点样面（无光泽面）向下，两端拉平紧贴于电泳槽架的滤纸垫上，点样端在阴极，盖上槽盖。 • 通电: 电压110-120 V，50-60 min。 • 关闭电源。

  12. (四) 染色与漂洗 • 取出膜条，浸入氨基黑10B溶液中 • 染色5 min(浸透后再放第二张)。 • 取出薄膜，浸入漂洗液中漂洗3-4次 • 至背景基本无色，呈现出清晰的血 • 清蛋白电泳图谱，晾干备用.

  13. 清 蛋 白 α 2 α 1 γ β 人血清蛋白电泳图 — + 人血清脂蛋白电泳图

  14. (五)定量(洗脱定量法与扫描定量法) • 1 洗脱： • 取试管6支，依次编号为0（空白）、A、α1、α2、β、γ，各管中加0.4mol/L NaoH 5ml。将电泳图谱按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开，分别装入相应试管中。在图谱两端无蛋白部位剪一大小与α1相同的薄膜放入空白管。反复摇动，使薄膜上染料充分洗脱在NaOH液中

  15. 2 比色 • 在波长650nm，以空白管调零，读取清蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。

  16. 3 计算 • 先按下式计算光吸收值总和(T): • T = A + α1 + α2 + β + γ • 再按以下算式计算各组分蛋白质的百分数 • 清蛋白 (%)＝（ A/T ）×100% • α1球蛋白(%)＝（α1/T）×100% • α2球蛋白(%)＝（α2/T）×100% • β球蛋白 (%)＝（β/T ）×100% • γ球蛋白 (%)＝（γ/T ）×100% • A/G ＝ A÷(Aα1＋Aα2＋Aβ＋Aγ)

  17. 五、注意事项 • 醋酸纤维薄膜的预处理 • 点样位置及上样量 • 薄膜在槽中的摆放方向和膜面的朝向 • 电压电流的高低与分离效果 • 控制染色方法和时间

  18. 六、思考题 • 为什么电泳时采用pH8.6的缓冲液？ • 与滤纸电泳比较，血清蛋白醋酸纤维 • 薄膜电泳有哪些优点？

  19. 影响电泳的因素 1、质点的大小、形状、带电性质 2、溶液的pH: pH=pI; pH>pI; pH<pI 3、电压大小: 10～12V/cm长 4、电流强度: 0.4～0.5mA/cm宽 5、电渗:溶液对固定相的相对移动

  20. 电泳方向: 受带电性质， 溶液的pH决定和影响. 用 途: 分离纯化蛋白质.

  21. 急性肾炎 营养不良水肿 肝脾肿大 红斑狼疮 某些疾病患者血清醋酸纤维薄膜电泳结果

  22. (五) 透明 将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明A液2分钟→随即转入B液1分钟→取出后将薄膜平贴于玻璃板上3～5分钟→薄膜完全透明。膜与玻璃板间不能有气泡。 干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。

  23. 透明（P、76） • 扫描 用光密度扫描分析仪，扫描透明 过的电泳薄膜，便可得出电泳曲线，即距离—光密度曲线（图）。 • 求积定量 算出曲线每个峰的面积与总面积的百分比，就是各区带蛋白质占血清总蛋白的百分比。 2 扫描定量法

  24. Let's begin！

More Related