1 / 25

Az RNS interferencia szerepe a génregulációban

Az RNS interferencia szerepe a génregulációban. Az RNS interferencia felfedezése : az RNS interferencia jelensége, felfedezése miRNS : a miRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában 3. miRNS célpontok keresése állatokban. 1. Az RNS interferencia felfedezése.

gamma
Download Presentation

Az RNS interferencia szerepe a génregulációban

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Az RNS interferencia szerepe a génregulációban

  2. Az RNS interferencia felfedezése: az RNS interferencia jelensége, felfedezése • miRNS: a miRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában 3. miRNS célpontok kereséseállatokban

  3. 1. Az RNS interferencia felfedezése • 2006: orvosi Nobel-díj Craig C. Mello, Andrew Fire • Kísérletek: C. elegans-on (fonálféreg) 1. az elcsendesíteni kívánt gén mRNS-ével egyszer azonos, másszor ellentétes szekvenciájú RNS bejuttatása → génelcsendesítés mindegyik esetben ha egyszerre juttatták be → erősebb génelcsendesítés 2. az állatokat genetikailag módosított baktériumokkal etették (az állat egyik génjének mRNS-ével azonos felépítésű duplaszálú mRNS-eket termelt) → úgy viselkedtek, mint akiknek nincs adott működőképes génjük (Nature: 1998-ban publikálták)

  4. 2. A mikroRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában Transzkripciós faktorok, miRNS-ek és azok születése sokfajta génszabályozás -transzkripciós faktorok: • fehérjék, gátolják vagy aktiválják a transzkripciót • kis cisz-regulációs elemekhez kötődnek -mikroRNS: érett mikroRNS: •rövid, nemkódoló ssRNS-ek (egyszálú RNS), amelyek gátolják a mRNS-ek transzlációját • kötődik a mRNS vele komplementer szakaszához (miRNS kötőhely) ≈70 nukleotidból álló hajtű struktúrából vágódik ki (pre-miRNS) a Dicer enzim vágja ki

  5. pre-miRNS: a pri-miRNS-ből (primery miRNS) vágja ki a Drosha enzim pri-miRNS: a DNS-ből az RNS-polimeráz II. által átírt elsődleges miRNS átirat több száz nukleotid hosszúságú is lehet, több pre-miRNS-t tartalmazhat néha a fehérjekódoló gének intronjaiban vannak (a splicinggal vágódnak ki) Növényeknél a miRNS érés a sejtmagban történik.

  6. Humán genom: 328 miRNS-t azonosítottak eddig nagyobb, mint 1%-a a géneknek miRNS-t kódol a fehérjekódoló gének több, mint 30%-áról hiszik azt, hogy miRNS-ek regulálják Arabidopsis: 199 miRNS

  7. A miRNS-ek felfedezése • ~22 nukleotid hosszú RNS-ek • A mRNS-hez kötődnek, génelcsendesítés: → hasítás → transzlációs represszió 1993: Victor Ambros, Rosalind Lee, Rhonda Feinbaum • Felfedezik, hogy a lin-4 C. elegans-ban található gén, ami a lárvafejlődés időzítéséért felelős nem fehérjét, hanem egy pár rövid RNS-t kódol • Az egyik RNS ~22 nukleotid hosszú, a másik ~61 nukleotid hosszú • A lin-4 RNS-eknek „antisense” (a mRNS átirat szálával komplementer) komplementaritásuk van több helyhez a lin-14-es gén 3’ UTR szakaszában → csökken a LIN-14 fehérje mennyisége anélkül, hogy a lin-14 mRNS mennyisége csökkenne  modell: a lin-4 RNS a lin-14 3’ UTR-jének egy szakaszával párt alkot, transzlációs repressziót végez (egy regulációs útvonal része, ami az első lárva állapotból a második lárva állapotba való átmenetet indítja el)

  8. 2001: a rövidebbik lin-4 RNS a kicsi reguláló RNS-ek csoportjába tartozó RNS: miRNS • 2003: miRNS funkciók eddig: • sejtosztódás • sejthalál • zsír metabolizmus a legyekben • neurális mintázatok kialakulása a nematodákban • levél- és virágfejlődés a növényeknél

  9. A., C.Elegans stem loop-ok a lin-4, let-7 esetébenB., Példák állatokban található stem loop-okra (a mir-1, mir-34, mir-124 esetén) C., Három Arabidopsis stem loop (MIR165a, MIR172a2, JAW) piros: értett miRNS-ek kék: kísérleti úton megtalált szekvenciák

  10. Növényi, állati miRNS • A növényekben a stem loop-okban lévő visszahajlások méret szempontjából sokkal változatosabbak, mint az állatokban • Növényekbennagyobb a komplementaritása miRNS és a stem loop másik karja között, mint az állatokban • Növényekben keskenyebb méreteloszlás van a miRNS 21 nukleotidja körül, mint az állatoknál, itt 22-23 nukleotid körül van az eloszlás

  11. Reguláció RNS interferenciával RISC komplex - Miután létrejönnek a miRNS-ek (növényekben, állatokban, gombákban), siRNS-ek (állatokban), csak az egyik szál kerül bele egy ribonukleoprotein komplexbe ( RNA including scilencing complex): RISC • Az elcsendesítendő mRNS-t olyan üzenetek alapján ismeri fel, ami a tökéletes, vagy majdnem tökéletes bázispárosodáson alapul - A RISC-en található endonukleáz hasítja a mRNS-t közel a komplementer szakasz közepéhez A RISC-et légy és emberi sejtekből izolálták - A miRNS-eket először a miRNP komplexben találták meg (miRNA ribonukleoprotein komplex) • ugyanazokkal a speciális tulajdonságokkal rendelkezik, mint a RISC, lehet, hogy a RISC egy altípusa - Amikor a miRNS:miRNS* duplexből a miRNS bekerül a RISC komplexbe, akkor a miRNS* degradálódik • A duplexnek az a szála kerül be a komplexbe, amelyiknek az 5’ végénél lazább a bázispárosodás

  12. mRNS hasítás, transzláció represszió Hasítás • Ha a mRNS és a miRNSkomplementaritása megfelelő, akkor hasítás Transzlációs represszió • Ha nincs megfelelő komplementaritás ahhoz, hogy hasítson → elnyomja a transzlációt Jelenség: A lin-4 RNS-ek expressziójával korreláltan csökken a LIN-14 fehérje mennyisége, eközben a mRNS-ek száma nem változik A lin-14 mRNS poliszóma profiljaaz első lárvaállapotban megkülönböztethetetlen a későbbi lárvaállapotokétól, amelyekben már a LIN-14 fehérje mennyisége csökkent

  13. Két lehetséges magyarázat: • lin-4 RNS a transzlációs iniciáció után elnyomja a transzlációt úgy, hogy nem változtatja meg a riboszómák sűrűségét az üzeneten (pl. riboszómák lassítása vagy megállítása) • A transzláció ugyanúgy folytatódik tovább, de az új szintetizálódó polipeptid specifikusan degradálódik Néhány megjegyzés: - Jelentős komplementaritás kell a hasításhoz • Az állatoknál kisebb mértékű a komplementaritás, mint a növények esetében → az állatoknál jelentősebb a transzlációs represszió, mint a növényeknél - Több RISC komplex hatására történik hatásos transzláció inhibíció, ezért is jó, ha több miRNS komplementer hely van a mRNS-en (állatoknál) - Néhány miRNS a DNS transzkripciós csendesítését is végezheti

  14. A., mRNS hasítás B., transzlációs represszió C., transzkripciós génelcsendesítés

  15. 3. miRNS célpontok keresése állatokban Korai szakasz: - (2003) egy légy miRNS (bantam) negatívan regulálja a pro-apoptotikus hid gént hid gén → híd fehérje: elősegíti az apoptózist (gátolja az apoptózist gátló faktort (IAP), így teszi lehetővé, hogy bekövetkezzen az apoptózis) - a Drosophila, gerincesek esetében sok más miRNScélpont-jóslás a következők alapján: 1. kevés kísérletileg azonosított valószínűsíthető célponthoz való kapcsolódási hely (20 kapcsolódási hely 2 miRNS-re Drosophilában) 2. Megfigyelés: az ismert poszttranszkripciós regulációs motívumok a 3’ UTR- ben teljes mértékben komplementerei néhány légy miRNS 5’ végének 3. in vitro kísérletek eredménye: több kapcsolódási hely a 3’ UTR-ben exponenciálisan megnöveli a mRNS elcsendesítésének mértékét Ezek az eljárások nem csak a komplementaritás alapján értékelték a miRNS-mRNS párokat, hanem a kapcsolódáskor érvényes szabadenergiára is. (scoring)

  16. kiderült: 6-8 bp hosszú szakaszok, amelyeknél tökéletes Watson-Crick bázispárok alakulnak ki a miRNS-mRNS között → ezek segítettek a legtöbbet a szabályozott mRNS-ek megtalálásában • általában a miRNS 5’ végén helyezkednek el (seed site) A 6-8 bp hosszú tökéletes W-C bázispárokból álló szakaszokat nukleusznak szokták nevezni • A létrejött nukleusz, (legyőzve a hőmozgást) a két szál gyors összecipzározódását segíti elő majd a mRNS-miRNS duplexben bázispárok kialakulásával termodinamikailag stabilizálódik a rendszer - Az algoritmusok kapcsán felmerülő szempontok, nehézségek • Állati miRNS-ek esetén a kapcsolódási hely kicsi, ezért korlátozott a komplementaritása → ha kis eltérés van az algoritmusban, nagy eltérés lehet a célpontmeghatározásban • általában az algoritmusok az evolúciós szempontból konzervált kapcsolódási helyeket tekintik biológiailag fontosnak célpont-meghatározás szempontjából

  17. •különböznek az eljárások a következőkben: a kapcsolódási helyek konzerváltságának mértékét máshogy határozzák meg (scoring szabályai) az ortológ 3’ UTR szekvenciát hogyan definiálják, hogyan vizsgálják • probléma: hogyan vegyék figyelembe a 3’ UTR szekvencia hosszát → rövidebb 3’ UTR- ben lévő kapcsolódási hely hatékonyabban vagy kevésbé hatékonyan csndesíti a mRNS-t (hogyan számítsuk bele a score-ba)

  18. Célpont-meghatározás ma: • Kapcsolódási hely mutációs kísérleteken és az azt követő bioinformatikai analízisen alapul (gyakran felhasználják a fajok összehasonlításából kapott eredményeket) a mutációs kísérletek megmutták: kétfajta célpont létezik 1. Tökéletes W-C bázispárok kialakulása a miRNS 5’ végének ‘seed’ szakaszához 2. Nem tökéletes illeszkedés az 5’ végen lévő szakaszhoz, további bázispárok alakulnak ki a miRNS 3’ végénél • Az első csoportba tartozó kapcsolódási helyek száma egy nagyságrenddel nagyobb, mint a második csoportba tartozók száma

  19. a., Az első csoporthoz tartozó és a b., a második csoporthoz tartozó miRNS-ek kapcsolódása a mRNS-hez

  20. Az algoritmusok összehasonlítása: • ~ 130 kísérletileg meghatározott mRNS-miRNS (Drosophila) alapján értékelték az algoritmusokat (Cohen Laboratory, EMBL) • A legjobban szereplő két algoritmus: PicTar, EMBL: 90%-os pontosság (annak a valószínűsége, hogy az algoritmus konzisztens a kísérlettel) 70-80% érzékenység (mennyire képes az algoritmus tényleges mRNS-miRNS párokat találni) A többi algoritmus nem ért el ilyen érzékenységet és pontosságot, de sok más célpontot is megtalált

  21. mRNS-miRNS párok: (példák) miRanda miRBase PicTar TargetScan, TargetScanS RNA hybrid mRNS-miRNS párokat kereső eszközök: RNAhybrid DIANA-MicroT RNA22 mRNS-miRNS párok kísérletileg alátámasztott adatbázisa: Tarbase Argonaute miRNAMAP

  22. ##txt Format ##source-version miRanda 3.0 ##created on:2007-10-31 ##GROUP SEQ METHOD FEATURE CHR START END STRAND PHASE SCORE PVALUE_OG TRANSCRIPT_ID EXTERNAL_NAME Similarity cel-miR-785 miRanda miRNA_target III 1772526 1772547 - . 18.9884 2.999100e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-796 miRanda miRNA_target III 1772391 1772413 - . 18.2142 3.818450e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III 1772565 1772588 - . 17.4222 2.849710e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III 1772565 1772588 - . 17.4222 2.849710e-02 Y39A3CL.4a Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-260 miRanda miRNA_target III 1765303 1765322 - . 17.2423 2.781390e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-262 miRanda miRNA_target III 1765264 1765283 - . 17.932 4.266260e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-36 miRanda miRNA_target III 1765281 1765302 - . 16.3733 2.782390e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-37 miRanda miRNA_target III 1765281 1765302 - . 15.691 4.356940e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-787 miRanda miRNA_target III 1759917 1759941 + . 17.0828 3.145560e-02 Y46E12A.2 Y46E12A.2 Similarity cel-miR-72 miRanda miRNA_target III 1751881 1751903 - . 17.9879 2.637880e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-60 miRanda miRNA_target III 1751955 1751977 - . 17.6485 2.983430e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III 1751881 1751903 - . 19.2323 9.934760e-03 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III 1751881 1751902 - . 17.2829 4.588090e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-266 miRanda miRNA_target III 1751881 1751900 - . 17.1274 4.344880e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 15.8384 3.247690e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.008910e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.294690e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.321450e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III 1723215 1723235 - . 16.3227 2.590130e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 16.4041 2.930900e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III 1723248 1723268 - . 16.1459 3.430470e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III 1723248 1723266 - . 16.2078 2.475660e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III 1723215 1723239 - . 16.1459 4.123270e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 15.8384 3.247690e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.008910e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.294690e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.321450e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III 1723215 1723235 - . 16.3227 2.590130e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 16.4041 2.930900e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III 1723248 1723268 - . 16.1459 3.430470e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III 1723248 1723266 - . 16.2078 2.475660e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III 1723215 1723239 - . 16.1459 4.123270e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-239b miRanda miRNA_target III 1716235 1716258 - . 16.6007 4.554820e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-269 miRanda miRNA_target III 1716473 1716492 - . 16.3227 4.615520e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III 1716472 1716494 - . 17.9879 2.771030e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III 1716472 1716494 - . 17.5103 3.831370e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 C. elegans miRNA-ek és célpontok

  23. Irodalom: Cell David P. Bartel: MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function Nature Genetics Nikolaus Rajewsky: microRNA target predictions in animals

More Related