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生物工程设备. 第三章. 生物反应器总论. 生物反应器总论. 3.1 生物反应器概述 3.2 生物反应动力学基础 3.3 生物反应器的通风和溶氧传质 3.4 一般生物反应器的操作和注意事项. 3.1 生物反应器概述. 3.1.1 生物反应器在生产中的地位和作用 1 ．生物技术和生物反应器
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生物工程设备 第三章 生物反应器总论
生物反应器总论 3.1 生物反应器概述 3.2 生物反应动力学基础 3.3 生物反应器的通风和溶氧传质 3.4 一般生物反应器的操作和注意事项
3.1 生物反应器概述 3.1.1 生物反应器在生产中的地位和作用 1．生物技术和生物反应器 生物技术是对生物物质有控制的应用。因此，生物技术不仅仅包括基因工程或者细胞融合技术，实际上，它的应用范围非常广泛，涵盖化工领域，如乙醇、微生物和有机酸类、聚合物的生产，制药领域，如抗生素、疫苗的生产，能源领域，如燃料乙醇，食品领域，如奶制品、蛋白质的生产，以及农业，如动物饲料、废物处理、微生物杀虫剂、植物移植配方的生产和应用。
3.1 生物反应器概述 2．生物反应器在生产中的地位和作用 如图3-1所示，在一般的生物工业中，生物有机体在生物反应器中生长、繁殖， 其所需的营养成分, 如葡萄糖(碳源)、蛋白质（氮源）、空气（氧）及其它必要的添加剂（前体）等，经适当处理和严格消毒后根据需要加入生物反应器中。生物有机体的生长环境，如温度，氧含量，PH值，经热交换、氧气含量控制、酸碱滴入等手段维持，以使生物体始终处在良好的生长状态。生物有机体在生物反应器中合成产品和其他代谢产物，经过一系列的分离过程后，得到最终产品。
3.1 生物反应器概述 图3-1 生物工业一般过程
3.1 生物反应器概述 3.1.2 生物反应器的类型 生物反应器有很多种，按照不同的分类角度可以分为各种类型，如表3-1所示。 柱塞流反应器（plug flow）指流体在反应器内从进口流到出口，中间没有返混，一些固定化细胞培养反应器、膜反应器及管式反应器等属于这种情况。 全混流反应器（backmix）指流体在反应器内经过了充分混合，搅拌罐式反应器是一种典型的全混流反应器。
3.1 生物反应器概述 表3-1 生物反应器的分类
3.1 生物反应器概述 表3-1(续) 生物反应器的分类
3.1 生物反应器概述 罐式反应器高径比在1：3之间，管式反应器高径比一般大于30， 塔式反应器高径比通常大于10。膜式反应器使用各种膜作为反应器内部关键组件，有时膜起分离作用，有时膜起固定化细胞和酶的作用。 均相反应器指反应器内只有一相，如均相酶反应器，酶作为催化剂溶解在反应液中，形成单一的液相。非均相反应器内反应物质有两相以上，比如，一般的生物反应器内有固相（生物体）、液相（培养液）、气相（空气），固定床和流化床也属于典型的非均相反应器。
3.1 生物反应器概述 对于需氧生物培养来说，空气和培养液如何混合接触是一个非常重要的因素。目前常用的混合方式有四种，如图3-2 所示。机械搅拌混合是靠搅拌器的作用将通入培养液内的空气分成大量小气泡，使其与液体充分混合接触。泵循环反应器依靠一个外置液体循环泵，将液体从反应器出口打回到入口，实现液体的循环并与空气进行充分接触。直接通气混合是将空气通过罐底气体分布器直接通入，实现气液混合接触。
3.1 生物反应器概述 1—搅拌混合； 2—泵循环混合； 3—直接通气混合； 4—连续气相接触 图3-2 生物反应器中4种不同的气液接触方式，图中的箭头表示气体流向
3.1 生物反应器概述 3.1.3 生物反应器的发展趋势 生物反应器的研究、开发和设计是生物技术的一个重要内容，一种好的生物反应器出现往往能够大规模降低生产成本，成为生物制品成功商业化的关键。因此，生物反应器的开发一直很活跃，尤其是最近的细胞生物反应器开发更是如此。生物反应器的发展趋势可归纳为以下几个方面。
3.1 生物反应器概述 1．微生物反应器朝着大型化发展。由于微生物可以悬浮培养，对搅拌的剪切力要求不高，因此，微生物最有条件在大型甚至超大型反应器内生长。目前，生产抗生素的发酵罐容积已达到400立方米，氨基酸的达到300立方米，单细胞蛋白（SCP）的达到2600立方米，用微生物处理废水的生物反应器甚至高达27000立方米。显然，反应器的增大有利于降低生产成本。我国生物反应器的容积在200立方米以下。
3.1 生物反应器概述 2．动植物细胞培养反应器得到较大发展。由于动植物细胞培养可以得到很多高附加值生物制品，如干扰物，单克隆抗体等，细胞培养反应器的开发越来越受到重视。 3．大量使用现代计算机技术进行生物反应器的设计和开发。首先，对反应器内的生物反应过程建立数学模型，获得能够反应生物过程规律的较精确的表达式，然后将该模型应用于反应器的设计和自动控制中，从而优化反应器的结构和操作。
3.1 生物反应器概述 3.1.4 一般生物反应器的结构原理 这里的一般生物反应器指机械搅拌罐式反应器（Stirred-tank bioreactor），这种反应器作为一般反应器是因为：首先，这是一类工业上最重要，应用最广泛的生物反应器，它具有双重优势，较低的制造成本和操作成本。 其次，这类反应器是较为普遍接受的标准生物反应器，除了因为它比较经济和容易放大外，大部分生物有机体都可以使用这种反应器进行培养，它们的生长环境在这种反应器内也比较容易得到满足和调节。图3-3是这种反应器的结构。
3.1 生物反应器概述 图3-3 一般生物反应器的结构
3.1 生物反应器概述 它的主要组成部分包括罐体，搅拌装置，换热器，除沫装置，气体和物料进出口以及检测和调节装置。生物体生长所需要的温度、酸度分别由罐内温度计和酸度计检测，并由夹套换热器和滴入酸碱进行调节和维持。搅拌器的上部有消沫装置，加上滴入的化学消沫剂，控制着罐内泡沫的产生。生物体在生长过程中产生的二氧化碳以及其他气体从空气出口经过滤后排出。搅拌和罐体之间有机械密封，使整个生物反应器处在密封无菌环境下。 返回
3.2 生物反应动力学基础 3.2.1 分批培养中细胞的生长 1．分批培养中细胞的生长过程 生物的分批培养是将大部分或全部生物所需营养物料一次性投入生物反应器，调节反应器内温度、pH值、氧化还原电位处于最有利于生物生长的状态，然后，接入生物体使其生长，直至一些关键的营养物质耗尽或者由于毒素积累或pH值发生变化等因素导致生长环境恶化。
3.2 生物反应动力学基础 如果以每升培养液中生物细胞干物质的克数X（克/升）代表生物体的生长情况，在分批培养情况下X随时间变化的曲线大致如图3-4所示。根据这个曲线，细胞生长大体上可分为六个阶段。图3-4 分批培养中细胞生长的几个阶段 ① 迟滞期（The lag phase）。 当生物种子被接入新鲜培养液时，细胞需要一定的时间适应新环境，因而出现一段相对静止的阶段（图中1），在这一阶段，细胞的总量和浓度保持不变。这一阶段的长短取决于细胞的个体遗传特性、种龄、接种量和环境等，一般为几个小时。
3.2 生物反应动力学基础 图3-4 分批培养中细胞生长的几个阶段
3.2 生物反应动力学基础 ② 加速生长期（acceleration phase）。如图中2， 在这一时期内，一部分细胞已经适应新的环境，开始生长和繁殖。由于细胞个体的差异，这种适应有快有慢，表现为细胞量的逐步增加。 ③ 指数生长期（logarithmic or experimental phase）。 又称对数生长期。在这一生长期内细胞的各成分以恒定的速度合成，表现在细胞含量的对数值与时间成直线关系，如图中3。在这一时期内，细胞的生命力最强。 ④ 减速生长期（deceleration phase）。由于细胞的生长，营养物质越来越少，培养液中积累的有毒代谢物也越来越多，细胞的继续生长受到限制，细胞浓度的增加逐渐减慢进入减速生长期，如图中4。
3.2 生物反应动力学基础 ⑤ 平衡生长期（stationary phase）。在减速生长期内，细胞的生长速度逐渐减慢，死亡的速度逐渐增加，当二者达到相等时便进入平衡生长期。 ⑥ 负生长期（decline or death phase）。 由于营养物质的进一步下降和有毒代谢产物的进一步积累，细胞的死亡速度开始超过生长速度，细胞的浓度呈增速下降趋势。在抗生素工业中，这一时期抗生素产物继续大量合成，但合成速度开始降低，直至细胞大量死亡和自溶，细胞浓度呈指数下降，抗生素的合成速度迅速降低直至停止。
3.2 生物反应动力学基础 2．比生长速率 μ（specific growth rate） 微生物细胞的生长是一个自催化（autocatalytic）过程，也就是说，细胞量增长的速度与细胞浓度成正比。在细胞的指数增长期内，细胞增长的变化符合这一规律。即每隔一个固定的时间间隔，细胞的量就要翻一番。设这一固定时间间隔为td, 如果细胞的初始浓度为X0（克干物质/升），经过时间t 后，细胞浓度为X（克干物质/升），则有下列关系式：
3.2 生物反应动力学基础 在上述公式中，μ即比生长速率，单位为h-1，实际上是细胞浓度的增加速度除以细胞浓度，或者每单位细胞浓度，细胞浓度的增加速度。td为细胞的倍增时间，即细胞重量增加一倍所需要的时间，近似等于细胞完成一个分裂周期所需要的平均时间。 如果忽略细胞死亡速率，且在反应过程中没有从反应器内取出细胞，则细胞在指数增长期的生长速度随时间的变化符合上述公式3-1或公式3-2所表达的数量关系。
3.2 生物反应动力学基础 3．莫诺德方程（Monod equation） 在分批生物培养中，当其他营养物质的浓度足以支持微生物以最大的生长速度生长，只有一种营养物质的浓度不足从而限制生物的生长，则生物生长速率和这种营养物质浓度的关系可以用莫诺德方程表示：
3.2 生物反应动力学基础 公式3-3中, μ—比生长速率(1/h)， μm—最大比生长速率(1/h) S—营养物质浓度(g/L) Ks—营养物质饱和常熟或者莫诺德常数（g/L）。 最大比生长速率μm实际上是当营养物质十分充足不再限制生物生长时的比生长速度，即当S>>Ks时的情况。 当 S>>Ks时， Ks可以忽略不计，莫诺德公式变为： 当Ks=S时， 莫诺德公式变为：
3.2 生物反应动力学基础 因此，莫诺德常数数值上等于比生长速率达到最大比生长速率一半时的营养物质浓度，它的大小表示了生物对营养物质的偏爱程度（affinity for the substrate）, 数值越大，生物对这种营养物质越不偏爱，反之亦然。最大比生长速率μm和莫诺德常数是两个重要的动力学常数，表征了某种生物的生长受某种营养物质影响的规律。莫诺德方程所表达的比生长速率和营养物质浓度关系如图3-5所示。
3.2 生物反应动力学基础 图3-5 比生长速率和营养物质浓度关系
3.2 生物反应动力学基础 在分批培养中，在指数生长期，S>>Ks , 因此μ=μm，在减速生长期，μ不再是常数，它随营养物质浓度的变化而改变。减速生长期一般非常短，有时甚至不存在。Ks的值越低，减速期越短。表3-2列出了几种生物对某些营养物质的饱和常数。 莫诺德方程是一个经验公式，表示了当某一种营养物质限制某种生物生长时，生物的生长与该营养物浓度的关系，当多种物质限制性因素出现，或更复杂情况时，莫诺德方程不一定适用。
3.2 生物反应动力学基础 表3-2 部分微生物对部分营养物质的饱和常数
3.2 生物反应动力学基础 3.2.2 分批培养中基质的消耗 1．得率系数、比产物生成速率和比基质（营养物）消耗速率。 ① 菌体得率系数（biomass yield coefficient）和产物得率系数(product yield coefficient) 在生物分批培养体系中，细胞浓度X（克干物质/升）、产物浓度P（克/升）、营养物质浓度（基质浓度）S（克/升）都随时间t（小时）变化，或者说都是时间t的函数。如果细胞浓度X对时间的导数是 ， 基质浓度对时间的导数是 ，产物浓度对时间的导数是 ，产物得率系数 和菌体得率系数 由下页两个式子定义：
3.2 生物反应动力学基础 也就是说，得率系数是产物或菌体浓度对时间的导数除以基质消耗对时间的导数，取正数。从上述定义也可以推出，得率系数实际上是产物或菌体生成速率对基质消耗速率的导数，取正值。如下公式所示：
3.2 生物反应动力学基础 因此，如果经过一个较段时间Δt后，系统的菌丝浓度增加了ΔX，产物浓度增加了ΔP， 某种营养物质（基质）浓度增加了—ΔS（或减少ΔS）, 则得率系数可由以下两个公式计算： 由此可见，菌体得率系数和产物得率系数代表了每消耗一个单位的某种营养物质，菌体和产物浓度的增加量。 表3-3列出了产朊假丝酵母(C. utilis)对不同基质的菌体产率系数。
3.2 生物反应动力学基础 表3-3 产朊假丝酵母对三种基质的菌体产率系数
3.2 生物反应动力学基础 ② 比产物生成速率（specific rate of product formation）和比基质（营养物）消耗速率(specific rate of substrate utilization) 和以上介绍的比生长速度μ类似，比产物生成速率qp和比基质消耗速率qs分别由以下公式定义：
3.2 生物反应动力学基础 2．基质消耗速率 生物培养中的基质消耗不仅包括微生物生长所需要的基质消耗，而且包括维持微生物生存和合成产物所需要的基质消耗。因此，有下列关系： 系统 基质 的积 累速 率 微生物生长消 耗基质速率 维持生存基质 消耗速率 从系统中移出 基质速率 合成产物消耗 基质速率 外界 基质 供应 速率 － － － － ＝
3.2 生物反应动力学基础 在分批培养系统中，基质在培养前一次性加入，在培养过程中没有基质移出，因此，基质供应速率和系统移出基质速率都为零。由前述比生长速率、比产物生成速率、比产物和菌体得率系数的定义可推算出：
3.2 生物反应动力学基础 维持生存消耗基质速率 =每单位细胞浓度维持基质消耗速率✕细胞浓度以上公式中，每单位细胞浓度维持基质消耗速率称为细胞的维持系数(maintenance coefficient), 表示在细胞生长速度为零也没有产物合成的情况下，每单位细胞浓度基质的消耗速率。通常用m 表示。 则，在分批培养中，基质的消耗速率可以由以下公式表示： 公式中的参数代表的意义与前述相同。
3.2 生物反应动力学基础 很多情况下，尤其是通风发酵过程中，维持系数m远远小于μ/Yx/s, 可以忽略为0， 这时，如果没有产物合成，或者产物合成不消耗这种基质，公式 3-5 可简化为： 将比基质消耗速率定义式公式3-3引入公式3-5，得： 公式3-5、3-6和3-7都是描述分批培养中基质消耗的动力学方程，公式3-6适用于没有产物合成以及维持系数可以忽落不计的情况。
3.2 生物反应动力学基础 3.2.3 产物的生成 如果在生物细胞生长时有产物的合成，产物合成的速率有以下关系： 合成产物的总速率=产物的合成速率—产物移出速率—产物降解速率 在分批培养过程中，一般没有产物的移出，如果不考虑产物降解，产物生成速率由下列公式表达：
3.2 生物反应动力学基础 在实际的分批生物培养系统中，按照与生物细胞生长的关系，产物的生成可分为三种情况： 1．产物的生成与生物细胞生长完全相关。即产物是生物生长时直接代谢的产品，或者是生物代谢的中间产物。从生物细胞生长的开始，产物一直伴随着细胞的生长，产物浓度和产品浓度密切相关，如图3-6（a）所示。乙醇、氨基酸和微生物的发酵属于这种情况。
3.2 生物反应动力学基础 在这种情况下，产物的代谢速率可由下式表示： 式中，Yp/x为每单位干重量细胞生产产品的重量，称为产物生长因子（product yield coefficient）。μ和X分别是比生长速率和细胞浓度。
3.2 生物反应动力学基础 2．产物的生成与细胞生长部分相关。产物只是在细胞生长过程中的某一阶段产生，在其他阶段，没有产物生成。产物浓度和细胞浓度如图3-6（b）所示。乳酸的发酵生产属于这种情况。在这种情况下，产物的生成速率可由以下公式表示： 式中，α1和β1分别为生长相关因子和非生长相关因子，为常数，其他参数同前述。将公式3-9两边同除一个X，再将比产物生成速率和比生长速率定义公式代入，得：
3.2 生物反应动力学基础 3．产物的产生与生物细胞的生长无关。这种产物也称次级代谢物（Secondary metabolites）, 它与细胞的生长没有必然的关系，一般在细胞停止生长后才大规模产生，产物浓度和细胞浓度随时间的变化曲线如图3-6（c）所示。由于它和细胞生长没有必然的联系，因此，无法将这种产物的产生和细胞的生长相关联。研究这种情况下的细胞生长情况，需要使用前述公式3-5或者3-7。抗生素以及一些微生物毒素的发酵生产属于这种情况。
3.2 生物反应动力学基础 图中 (a) 产物形成和细胞生长完全相关 （b）产物的形成和细胞的生长部分相关 (c) 产物的形成和细胞的生长无关 返回 图3-6 分批培养中细胞的生长和产物的形成。
3.3 生物反应器的通风和溶氧传质 生物工业生产很多都是深层需氧发酵过程，在这些过程中，生物的生长和繁殖需要大量的氧气，提供氧气的办法是向发酵罐培养液内鼓入空气，这一过程就是生物反应器的通风。生物一般只能利用溶解在发酵液中的氧。氧气在水中的溶解度很小，在一个大气压、25℃下大约只有0.2 mmol/L，而微生物在工业培养中氧气的消耗量又很大，一般为20～25 mmol/L，因此，必须不断地向生物反应器通入空气，以保持培养液中溶解氧的浓度，。
3.3 生物反应器的通风和溶氧传质 3.3.1 气-液相间的溶氧传质理论 在向培养液通风时， 空气在培养液内形成大量的气泡，氧气首先从气泡内进入培养液成为溶解氧，然后从培养液进入生物细胞体内供细胞消耗。因此，氧气从气相传递到微生物细胞内的过程可分为两步：1、氧气从气泡内跨过气液界面到达液体内部； 2、氧气从液体内部跨过液固界面进入生物细胞内。前者称为氧气在发酵液中的气-液传递过程，后者叫做氧气的液-固传递过程，如图3-7所示。
3.3 生物反应器的通风和溶氧传质 图3-7 氧气在发酵液中的传递过程
3.3 生物反应器的通风和溶氧传质 氧在气液间的传递符合双膜理论，其基本论点如下：图3-8 双膜理论示意图 ① 相互接触的气、液两相存在着稳定的相界面，界面的两侧各有一个很薄的滞流膜层，在气相一侧的称为气膜，液相一侧的叫做液膜。氧气分子以扩散的形式通过此二膜层。如图3-8所示。 ② 在相界面处，气、液两相达到平衡。 ③ 在膜层以外的气、液两相中，氧气的浓度基本相等，全部浓度变化集中在两个膜层内。
