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肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制

肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制. 主讲人：杜标炎 广州中医药大学. 课题资助情况. 国家自然科学基金（编号： 30171201;30 572433; 30672747 ） 广东省科技攻关计划（编号： 2005B3030102 ） 广州市科委（编号： 2002J1-C7401 ） 广东省中医药管理局（编号： A401028 ； 1050079 ） 广州中医药大学 (K0050031). 内 容. 研究背景及研究思路 HSV-tk/GCV 肿瘤自杀基因治疗系统的构建 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用 中药方药增效作用的机制

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肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制

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Presentation Transcript

  1. 肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制 主讲人：杜标炎 广州中医药大学

  2. 课题资助情况 • 国家自然科学基金（编号：30171201;30572433; 30672747） • 广东省科技攻关计划（编号：2005B3030102 ） • 广州市科委（编号：2002J1-C7401） • 广东省中医药管理局（编号：A401028；1050079） • 广州中医药大学(K0050031)

  3. 内 容 • 研究背景及研究思路 • HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 • 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用 • 中药方药增效作用的机制 • 肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作

  4. 研究背景及研究思路

  5. 基因治疗的概念 基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法

  6. 基因治疗的策略

  7. 基因治疗的临床试验

  8. 肿瘤的基因治疗 恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，容易复制动物模型等原因而成为首选对象

  9. 目前常用的肿瘤基因治疗方案 • 肿瘤的免疫基因治疗 • 肿瘤抑制基因治疗 • 自杀基因治疗（最有应用前景） • 肿瘤多药耐药性基因治疗 • 抑制血管生成的基因治疗

  10. 自杀基因的概念 所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因 目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，引起细胞死亡

  11. 基因名称 底物 产物 旁杀伤效应 备注 单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk） GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷类似物 磷酸化的核苷类似物 有 研究最多 已上临床 水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（VZV-tk） araM araATP － 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC-CD） 5-FC 5-FU 有 已上临床 大肠杆菌硝基还原酶（NTR） CB1954，MTZ，NFT 羟胺衍生物 有 研究正在兴起 大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（EC-XGPRT或gpt基因） 6TG 6TX 6-硫代鸟嘌呤酸 有 细胞色素P450 CYP 2B1 CPA，IFA 碱性化的底物 有 细胞羧肽酶G2（CPG2） CMDA 芥类药物 有 大肠杆菌DeoD 基因（PNP） Mep-dr 6-甲嘌呤 有 白细胞介素1β转化酶（ICE） RARP，Lamins Rb，U1-70kD等 被降解 失活的底物 － p53 － － 有 目前应用于实验室和临床主要的自杀基因治疗系统

  12. 自杀基因治疗的优势 ①特异性杀伤基因表达细胞 ②杀伤多药耐药性（MDR）肿瘤细胞 ③基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达 ④绝大部分自杀基因存在极明显的“旁杀伤效应”，体外只需有10％以上的肿瘤细胞表达自杀基因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞 ⑤良好的瘤苗

  13. 旁杀伤效应

  14. 旁杀伤效应作用机制 • “缝隙连接”机制 • 免疫介导机制 • “细胞凋亡”机制 • 介质机制 • 抗肿瘤血管生成

  15. 缝隙连接机制

  16. 免疫介导机制 大量抗原释放 免疫细胞浸润 细胞因子释放 1 死亡 tk+ 免疫抑制 免疫激活 免疫炎症系统介导的 非特异性杀伤 诱发特异性 抗肿瘤免疫反应 旁杀伤效应增强 2 免疫增强 死亡

  17. “细胞凋亡”机制 • 自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋亡 • tk+细胞凋亡形成凋亡小体为tk-细胞吞噬引起tk-细胞死亡 细胞死亡 tk-细胞

  18. 介质扩散 5-Fc 5-Fu CD CD-细胞死亡 5-Fu 5-Fu 5-Fu

  19. 抗肿瘤血管生成 注： 自杀基因

  20. 单纯自杀基因治疗存在主要问题 目的基因转染率低而杀伤力不足；缺乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织特异性和时序性等，单纯自杀基因治疗难以完全消除肿瘤细胞

  21. 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 • 双自杀基因治疗 • 联合治疗 联合免疫基因治疗 联合放射治疗 联合化学治疗 联合其他基因 • 靶向基因治疗 • 增强旁杀伤效应

  22. 研究思路 单纯自杀基因治疗 载体转染效率低 靶向性不够 易复发 联合治疗增效 • 肯定的免疫药理作用 • 多靶点作用 • 给药方便，价格低廉，毒副作用小或无明显毒副作用 联合免疫基因 联合放化疗 多基因间互相干扰，难以保证导入基因表达或长期表达；使用病毒载体量增多，潜在毒副作用增大；操作过程复杂，成本较高 联合中药方药 提高旁杀伤效应 增强“缝隙连接”功能 增强杀伤敏感性 增强免疫功能 自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案

  23. HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

  24. 技术路线 获得目的基因 病毒滴度测定 酶切酶切鉴定 病毒感染胃癌细胞 质粒重组 斑点杂交鉴定 GCV杀伤试验 重组质粒鉴定 病毒包装和阳性克隆筛选

  25. 目的基因（tk基因）的获得 由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士提供 （ pICl9R/MCl-tk质粒）

  26. pICl9R/MCl-tk质粒酶切鉴定结果 1 2 3 4 5 a：pICl9R/MCl-tk质粒结构图b：pICl9R/MCl-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱 注（b）：1：Marker(λDNA HindⅢ)； 2：pICl9R/MCl-tk质粒 3：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ； 4：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ+EcoRⅠ 5：Marker(λDNA /EcoRⅠ+ HindⅢ)

  27. 重组质粒的限制性内切酶鉴定结果 • 1 2 3 4 5 6 a：pLXSN-tk质粒结构图 b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱 1．DNA marker Ⅸ(分子量分别为2.5kb, 2.0kb , 1.5kb , 1.0 kb, 500bp, 300bp) 2．pLXSN-tk经EcoR I单酶切 3．4．pLXSN-tk经EcoR I/BamH I双酶切 5． pLXSN-tk质粒 6．DNA/ EcoR I/Hind Ⅲmarker

  28. 重组质粒的测序图鉴定结果

  29. a：G418筛选5d后的PT67 b：筛选2w后形成的阳性克隆细胞 图3 pLXSN-tk质粒转染包装细胞PT67结果 PT67包装细胞筛选结果

  30. 病毒滴度测定及结果 本实验测定滴度最高为1×104cfu/mL

  31. 1 2 3 胃癌细胞tk基因的斑点杂交鉴定 胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/tk的 DNA 与tk探针的斑点杂交图 注：1. pLXSN/ tk 质粒DNA（阳性对照）； 2. SGC-7901细胞DNA； 3. SGC-7901/tk细胞DNA

  32. GCV对人胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤试验

  33. 结论及意义 • 已成功已成功构建了逆转录病毒载体介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统 • HSV- tk/GCV自杀基因治疗系统成功的构建，为后续的研究工作奠定了坚实的基础

  34. 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用

  35. 动物水平实验

  36. 小鼠移植性肝细胞癌治疗实验(六味地黄) • 技术路线 病毒感染肝癌细胞 动物分组 GCV体外杀伤试验 成瘤后治疗 H22/tk＋和H22/tk－按1∶4混合 疗效观察 接种小鼠皮下组织 （ 2×106细胞 ）

  37. 分组及治疗 第2天 第6天 第16天 蒸馏水灌胃每天0.5mL 正常对照组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （生理盐水） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 模型对照组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 六味地黄丸治疗组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 自杀基因治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1 （造模） （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 联合治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

  38. 肿瘤生长体积曲线 时间（d）

  39. 肿瘤质量及抑瘤率 注：*与模型对照组比较P<0.05 抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%

  40. 肿瘤质量图示

  41. 病理检查结果(肉眼观察) 注：第二组：肿瘤模型组；第三组：六味地黄丸治疗组；第四组：自杀基因治疗组； 第五组：联合治疗组

  42. 病理检查结果(光镜观察) 六味地黄丸治疗组 肿瘤细胞数量较多，密集。 模型对照组 肿瘤细胞数量较多，密集。 联合治疗组 肿瘤细胞数量密度相对较低。 自杀基因治疗组 肿瘤细胞数量密度相对较少。 各组细胞密度

  43. 六味地黄丸治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 模型对照组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 自杀基因治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 联合治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织。 各组肿瘤坏死情况

  44. 模型对照组：肿瘤周边纤维组织增生不明显，未见明显包膜 六味地黄丸治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜 联合治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较厚的假包膜 自杀基因治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况

  45. 模型对照组：肿瘤边缘见少量炎细胞浸润 六味地黄丸治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润 自杀基因治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润 联合治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见大量炎细胞浸润 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况

  46. 肝癌治疗实验结论 自杀基因疗法与六味地黄丸联合应用于小鼠移植性肝细胞癌的治疗具有协同效应，表明六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性肝细胞癌具有增效作用

  47. 丹参注射液 H22肝癌荷瘤小鼠剥落瘤块照片 A 模型对照组； B 丹参组； C tk/GCV组； D 联合组.

  48. 小鼠移植性黑色素瘤治疗实验 • 技术路线 病毒感染黑色素瘤细胞 动物分组及治疗 GCV体外杀伤试验 疗效观察 tk＋和tk－细胞按1∶4混合 接种小鼠皮下组织 （ 1×106细胞 ）

  49. 分组及治疗 第2天 第7天 第27天 蒸馏水灌胃每天0.5mL 正常对照组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （生理盐水） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 模型对照组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 自杀基因治疗组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 六味地黄丸治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1 （造模） （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 联合治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

  50. 成瘤时间 六味地黄丸治疗组 自杀基因治疗组 模型对照组 联合治疗组 接种 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

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