Contoh:

1. Contoh: Aplikasi bioteknologi di bidang pertanian

2. BACULOVIRUS • Virus pada insekta • Pertamakaliditemukan pada Bombix mori • Virus mempunyai kapsid diameter 40-50x 200-400 nm • Ds-DNA, sirkuler, 80-200 kb • Membentuk struktur occlusion body, yaitu virus + selubung nukleokapsid yang dibungkus matrix kristalin protein • Nuclear polihydrosis virus (NPV), mempunyai occlusion body yang besar: insektisida • Virus dipelihara pada insect cell culture, yang ditumbuhkan pada Grace’s medium

3. MEKANISME NVP MENYERANG LARVA INSEKTA • Larva makan daun/tanaman yang mengandung NVP (PIB) • PIB-kristalin matrix larut dlm cairan mitdgut insekta yg alkalin • Embedded virion terbebas • Virion masuk sel-sel midgut melalui fusi ke membran mikrofili, shg tjd polarisasi sel-sel midgut shg bagian dalam dasar membran pecah dan baculovirus terbebas. • Virus masuk hemocoel kmd ditranspor mll hemolymph ke jaringan lain. • Virus menginfeksi sel-sel epithelial tracheole yaitu sel-sel yg berfungsi menyediakan O2 utk midgut. • Insekta kekurangan O2, dan mati

4. PERMASALAHAN • Bagaimana memelihara kestabilan virus agar tetap infeksius dalam kultur sel • Bagaimana meningkatkan efektivitasnya • REKAYASA GENETIK • Determinasi gen-gen virulensi, karakterisasi fungsi gen, dan mekanisme regulasi gen-gen parental virus • Memilih transfer plasmid dan konstruksi gen-gen parental virus dengan memilih promoter mis. polh, yaitu gen utkenandai transfer plasmid utk (occ +/- dalam konstruksi plasmid –virusyg mengandung lac Z (marker) • Occ + : white colonies, Occ- : blue colonies (skrining keberhasilan terjadinya single/double recombinant) • Identifikasi pengexpresian gen :koexpresi dua atau lebih gen target • Optimimisasi expresi gen:

5. Bacillus thuringiensis, (Bt') • Bakteri insecticidal, diisolasi dari tanah • Sudah dipasarkan secara meluasutkpest control • Umum utk caterpillar Lepidoptera (butterflies and moths),juga larva nyamuk, dansimuliidblackfliesyg merupakan vektor river blindness diAfrika. • Produk Bt merupakan 1% dari total ‘agrochemical’ market (fungisida, herbisidadaninsektisida) • Produk Bt berupa tepung yg mengandung campuranspora–spora kering dankristal toxin • Gentoxin sudah genetically engineered kedalambeberapa tanaman pertanian (see:Agrobacterium). • Metode yg digunakan, mode of action, dan host range dragenbiokontrolini sangat berbedadngmilikBacillus popilliae.

6. Sejarah, produk dan insektasbg host range • Bacillus thuringiensispertamakali ditemukan pada 1911 sbg patogen pada kumbang tepungdi provinsi Thuringia, Germany. • Semula digunakan sbg insektisida komersial di Perancispd 1938, kemudian di USA pd 1950an. • Tapi produk ini kmd diganti dng suatu produk yg lebih efektif pd 1960an, yaitu ketika bermacam-macam strain yg sangat patogenik ditemukan dng aktivitas yang lebih spesifikmelawan tipe-tipe insekta yg berbeda

7. Bacillus thuringiensisdiamati dng phase contrast microscopy. • Sel-sel vegetatifmengandungendospora (phase bright) dan kristal protein insektisidal toxin (delta endotoxin). • Kebanyakan sel-selnya lisis dan dibebaskanspora-sporadankristal toxin (Strukturnya berbentuk bipyramidal).

8. Studistruktur delta-endotoxin menunjukkan ada tiga domain. • Domain Iberupa satu bendel 7 alpha-helices, bbrp atau semua akan mensisipikdlmmembran sel usus besaryg menyebabkan terbentuknya porishg ion-iondapat melewatinya dgn bebas. • Domain IItdr atastiga antiparalel beta-sheets, serupa dng daerah antigen-binding dari immunoglobulins, sepertinya domain ini terikat pd receptor dlmusus besar. • Domain IIIdipaket beta-sandwich dng kuatyg diprotek pd exposed end (C-terminus) dr toxin aktif, melindungidr cleavage berikutnya oleh protease usus besar. Diphtheria toxin (dr bakteria lain) memiliki struktur utama serupadgn Bt toxin.

9. . Diagram based on: J Li, J Carroll and DJ Ellar, 1991.Nature353, 815-821]

10. Bacillus thuringiensis • Di Alam: membentukspora yang memproduksikristal protein ygdapatmeracuni larva beberapaseranggahama. • 1982. Held et al.mengisolasidanmengkarakterisasi protein kristalygberpotensisebagaiinsektisidadarisuatu strain Bt: GEN cry • Racun Bt melekat pd ephithelial glycoprotein dalamusus (terutamausustengah) seranggasehinggaususbocor & cairanususmerembeskedaerahantarahemocoel & usus. MATI. • Transformasi gen cry dari Bt tipe liar ketanaman: mengexpresikandayameracunygrendah, karenasekuensigennyabanyakmengandung A-T, daninimenyebabkan mRNA dalam tan transgeniktidakstabil

11. Mode of action • Kristal-kristal teragregasi mjd protein besar (130-140 kDa) yg dsbtprotoxin – yg harus diaktivasi dulu sebelum bekerja • Protein kristal sangat tidak mudah larut pd kondisi normal, jadihrs masuk dulu ke manusia, hewan tingkat tinggidaninsekta. • Dpt mudah larutbila kondisi pH tinggi (diatas pH 9.5) – spt kondisi dalam usus tengahlarvalepidopteraBt adl agen insecticidal spesifik yg sangat tinggi • Setelah larut dlm ususinsekta, protoxindi cleave oleh protease usus utk memproduksi toxin aktif ~ 60kD. • Toxin ini dsbt delta-endotoxin yg akan mengikat sel-sel epithelial midgututk menghasilkan poridlmmembran sell danmeyebabkan ion-ion ter-ekuilibrasi (tjd perbedaan osmosis). • Hasilnya, usus segera ter-immobilisasi, sel-sel epithelial lisis, larva berhenti makan, dan pH usus mjd rendah oleh ekuilibrasidgn pH darah. pH rendah mengakibatkan spora bakteria berkacambah, danbakteriamengivasi inang dan meyebabkan lethal septicaemia.

12. Racun Bt melekat pd ephithelial glycoprotein dalamusus (terutamausustengah) seranggasehinggaususbocor & cairanususmerembeskedaerahantarahemocoel & usus, larvaakhirnya MATI. • Transformasi gen cry dari Bt tipe liar ketanaman: mengexpresikandayameracunygrendah, karenasekuensigennyabanyakmengandung A-T, daninimenyebabkan mRNA dalam tan transgeniktidakstabil

14. Kultivar tahan hasil rekayasa genetika1. Kapas Bt Serangan insekta pada Bt (kanan) dan non-Bt (kiri) pada cotton bolls Cotton bollworm Cotton boll transgenik envfor.nic.in/news/aprjun02/aftcbci.html

16. PenggunaanInsektisidapadaTanamanKapas H. armigera S. bigutula 8-12x 3-4x 1-2x Kapasbiasa-Terjadwal Kapasbiasa-Pengamatan Kapastransgenik-Pengamatan

17. ? MEKANIK PRODUKSI PESTISIDA PREDATOR HAMA JAGUNG PARASITOID • Biopestisida • Jagung Bt PATOGEN VIRUS CENDAWAN BAKTERI Ordo Lepidoptera NPV CPV Beauveria bassiana Bacillus thuringiensis Nuclear polyhedrosis virus (NPV) Cytoplasmic polyhedrosis virus (CPV)

18. PENGGEREK BATANG Ostrinia furnacalis (Asian corn borer = ACB) pada jagung PUPA LARVA DEWASA

19. 2. Jagung Bt Kanan: western corn rootworm, D. virgiferavirgiferaLeConte, and (Kiri) the northern corn rootworm, D. barberi Smith and Lawrence, European Corn Borer Ostrinianubilalis StarLink Cornmengandung protein Cry9 (gen Bt) YieldGard Rootworm transgenic corn, www.extension.umn.edu

20. Ulat jagung (corn earworm, Helicoverpazea) dan kupunya makan bulir jagung dan menyebarkan green mold (Aspergillusflavus).(Photo credit: Texas A&M University)www.sciencedaily.com/.../05/040511042956.jpg

21. J A G U N G Bt J A G U N G Non Bt Helicoverpa armigera (A dan B) dan Ostrinia furnacalis (C, D, dan E) pada daun jagung 5 hari setelah infestasi

22. J A G U N G Bt J A G U N G Non Bt

23. WT : Wild Type RB : gen yg RB CryIAc : Gen Cry Bt : gen Bt BtRB : penggabungan gen Bt & gen RB