基龍米克斯生物科技股份有限公司

1. 基龍米克斯生物科技股份有限公司 基因糾察隊 RNAi 業務部 謝政翰

2. 摘 要 RNA干擾（RNA interference，簡稱RNAi）技術，簡單 說是用來阻斷特定基因的活動。 生技醫藥界發表論文的重鎮《科學》雜誌（Science）， 便票選RNA干擾技術為2002年生技界最偉大的突破。美國諾貝爾生物學獎得主菲力普‧夏普（Phillip A. Sharp）更強調，這是過去10年、甚至過去數10年來最重要、最令人興奮的突破。目前至少有10多家生技公司用以開發新藥。 《財星》預言，這會成為生技醫藥的下一個聖杯。主要理由有兩個：一，可以找出特定基因的功能；二，可以用以開發出阻斷致病基因活動的新藥，例如能有效應用於抑制HIV病毒的感染與複製上。 這項技術的發現事實上出自意外，說明了研究新發現對生技界的重要性。

3. RNA干擾現象 • 長久以來，科學家就能夠將改造的基因引進實驗生物體內；但直到最近幾年，他們才發現某個方便且有效的法子，可以將細胞裡特定的基因給關閉。 • 實情是，幾乎所有的植物與動物細胞當中，都有內建的裝置，利用RNA﹙基因的信使分子﹚的ㄧ些獨特形式，自然而然地將特定基因消音。 • 演化出這項裝置的目的，在於保護細胞免受不懷好意的基因所傷害，以及在生長與發育之際，調節正常基因的活性。我們也可能發展出利用RNAi裝置的藥物，來預防或治療疾病。

4. 背景介紹 RNAi最初在植物中被發現，本是植物ㄧ種與生俱有的功能， 接著，這個現象在線虫﹙C.elegans﹚、果蠅及脊椎動物中被觀察到。

5. The discovery and conservation of RNAi 美國亞歷桑納大學基因學家喬金森（Richard Jorgensen），1990年初時在美國一家植物生技公司工作，研究內容之一是：將紫色牽牛花（花心如一顆星星）的色彩開發得更豔麗。喬金森把數個紫色素基因注入花中，原本希望牽牛花因此會「更紫」，結果卻令他大感意外，花不是變成白色，就是星星圖樣被扭曲得無法辨識。 科學家們過一陣子後才知道發生了什麼事：被注入的紫色素基因像病毒一樣，是個「侵入者」，花啟動生物機制想要消滅侵入基因，卻由於侵入基因和花本身的基因是一模一樣的，因此同時被消滅了。

6. 摘錄自：科學人﹐2003.09. p 50

7. 這項發現開啟了RNA干擾技術之門，也開發出找到基因特定功能的新方法；而要申請專利、或開發新藥，第一步就是得找出基因的特定功能。這項發現開啟了RNA干擾技術之門，也開發出找到基因特定功能的新方法；而要申請專利、或開發新藥，第一步就是得找出基因的特定功能。

8. RNAi was first discovered in plants and invertebrates Early RNAi discoveries included analysis of gene knockdown in C. elegans by the introduction of long dsRNA • The RNAi effect was first described in the 1990’s in plants • The C. elegans genome is known, so this was quickly established as a good model system for RNAi • dsRNA introduction by injection, soaking nematodes in solution containing dsRNA, dsRNA vectors in E.coli are fed to nematodes, electroporation into trypanosomes • In 2001 was the first successful introduction into mammalian systems • Early adapters of RNAi used non-mammalian systems, however this group is being dwarfed by the influx of scientists using mammalian model systems

9. dsRNA and the mammalian PKR response dsRNA會引起 dsRNA – dependent protein kinase R ﹙PKR﹚response，進而抑制轉譯作用，同時導致apoptosis。

10. Overview of RNAi mechanism in mammalian cells siRNA induced RNA degradation

11. Initiator step ＆ Effector step • dsRNA 經由dicer分解成21 到23 nucleotides﹙nt﹚的siRNA • siRNA ﹙duplex RNA﹚會與核酸分解酵素複合體﹙nuclease complex﹚結合形成不活化的 RNA Induced Silencing Complex ﹙RISC﹚ • RISC 經由打開 siRNA – duplex 後，形成單股的 siRNA – RISC • 此活化的 siRNA – RISC 會與同源配對的 targeted mRNA 結合 • 接著 RISC 會切斷 targeted mRNA 結合於 siRNA 3`端距離 12 個 nt 的位置 • 經由上述的機制，使特定基因的 mRNA 被切斷，進而促使細胞內特定基因轉錄後被抑制的作用，稱之為 RNA interference ﹙RNAi﹚ 摘錄自：http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/ AntisenseRNA

12. 10bp ladder siRNA (Dicer) siRNA (RNAse III) 3020 10 What is Dicer • Dicer is related to RNase III but also has conserved helicase and “PAZ” domains. • d-siRNA: Dicer-generated siRNA. • RNase III acts quickly and cleaves dsRNA to smaller products mostly (12-15nt species), while Dicer cleaves to 21-23nt. In our hands RNase III products cleaved to completion are not effective. RNase III vs Dicer

13. Why Do RNAi Experiments? RNAi is rapidly becoming the preferred method for knocking out expression of target genes • Identifying gene function can be quickly performed; RNAi provides rapid results compared to methods using dominant negative constructs • A growing number of companies do both over expression and RNAi in the target validation phase • RNAi is highly cost efficient compared to making knockout mice and works better than antisense RNA for knocking down gene activity • Researchers are being asked to include RNAi data in their grant applications and journal publications

14. siRNA is more effective than antisense Antisense is not effiecient (Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 9 2401-2407)

15. Three Most Widely Used Ways to generate siRNA in Mammalian Cells

16. Long dsRNA Dicer (RNase III) Pooled d-siRNA In Vitro Transcription then Dicing dsRNA to siRNA

17. Synthetic siRNA

18. shRNA U6 Vector shRNA siRNA DNA based shRNA: Vectors with pol III/pol II (H1/U6) promoter:

19. 將ㄧ小片段的基因序列﹙短於30個核甘酸的DNA ﹚包括正反方向，剪接在 DNA 載體上送入細胞內，細胞的 RNA 聚合酶 III 會精準的將其轉錄成正反二股的 RNA ，便可以形成 siRNA ，持續抑制基因活性 摘錄自：科學人﹐2003.09. p 58

20. Transfection is key step

21. AAAAAA… AAAAAA… RNA interference (RNAi) in Mammalian Cells Transfect gene specific siRNAs made from Dicer or synthetic siRNA oligonucleotides – takes advantage of natural system in the cell… (mammalian systems) dsRNA target (some embryonic stem cells)   21-23nt siRNAs Dicer (RNase III) processing/ Unwinding – naturally occurring   RNA Induced Silencing Complex (RISC) formation and activation mRNA cleavage and degradation

22. 核糖核酸干涉將成為治療方式 如果某個基因被發現是引起或使疾病惡化的原因，將可透過核糖核酸干涉而使基因沉默的方式來治療重大疾病，例如變異作用、或某些基因過度表現、及病毒的侵入所導致的疾病:癌症、愛滋病、C型肝炎，都是核糖核酸干涉基礎療法的極佳的選擇。

23. 摘錄自：科學人﹐2003.09. p 55

24. 條件式基因剔除應用在果蠅的實例 使果蠅體內表現轉錄活化子﹙transcriptional activator﹚GAL4 ，其表現是有組織專一性﹔另ㄧ隻果蠅帶有可以表現雙股 RNA 的轉殖基因，但其表現受到 GAL4 調控﹔若將兩隻果蠅交配，即可在特定的組織產生 RNAi 的效果 摘錄自：科學人﹐2003.09. p 59

25. RNAi as a powerful tool

26. 結語 利用 RNAi 技術在基因功能性的分析上，較傳統 gene knockout 技術要省時、省力、省錢，同時小分子的 siRNA 也相當有發展成為藥物的潛力。

27. Reference 1、劉志宏﹙Nelson C.Lau﹚﹐David P.Bartel﹐譯者：潘震澤﹐2003.09﹐RNAi - 神秘的基因糾察隊﹐科學人﹐P48 - 56。 2、簡正鼎﹐2003.09﹐siRNA – 獵殺信使，以小博大﹐科學人﹐P57 - 59。 3、騰達行﹐2003年8月第二期﹐RNA 干擾抑制作用 – RNA interference RNAi 簡介﹐Synapes﹐P4 - 9。 4、Ken C.Reed / Genetic Engineering News﹐Volume 23﹐譯者﹕王清忠﹐2004年1 / 2 月號﹐DNA 定向基因沉默技術可誘導 RNA 干擾及基因沉默﹐生物科技﹐P60 – 63 5、http://www.invitrogen.com/RNAi。 6、http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/ AntisenseRNA

28. THE END Thank you