生物工艺学

生物工艺学 主讲：河南大学生命科学学院杨生玉 E-mail: yangshengyu@henu.edu.cn

第三章生产中常用菌种的 分离、选育和保藏

带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置

第一节工业菌种的育种方针 • 工业菌种的育种： • 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

工业菌种育种的方法 • 诱变 • 基因转移 • 基因重组

育种过程 • 包括下列3个步骤： • (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。 • (2)希望基因型的选出。 • (3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。

选择育种方法时综合考虑的因素 • (1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)； • (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度； • (3)经济费用。 • 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术： • 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。

工业菌种改良方法 • (1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。 • (2)增加前体物的浓度。 • (3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。

(4)抑制或消除产品分解酶。 • (5)改进菌种外泌产品的能力。 • (6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。

提高特定基因的表达水平 • (1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。 • (2)诱导解除基因表达抑制的突变。

改进菌种的生长效率 • 提高菌株对底物的利用率方法： • a. 通过确定并改变代谢中的耗能部分; • b. 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 • c. 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。

第二节诱变育种 • 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。 • 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。

诱变物理、化学或生物诱变方法

一、诱变剂和诱变处理 • 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子； • 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 • 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。

化学诱变剂： • 化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。 • 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 • 使用化学诱变剂的优缺点： • 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费用大，并要注意安全性。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 • 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。

诱变剂的选择 • 1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。 • 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。

3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 • 4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。

二、诱变育种步骤 • 出发菌株的选择 • 处理菌悬液的制备 • 诱变处理 • 中间培养 • 分离和筛选

(一)出发菌株的选择 • 1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 • 2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 • 3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 • 4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。

5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 • 6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。

(二)处理菌悬液的制备 • 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。

(三)诱变处理 • 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。

(四)中间培养 • 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。

方法： • 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。

(五)分离和筛选 • 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 • 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. • 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。

紫外线的诱变育种 • 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。

被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 • 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

(二)操作步骤 • 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 • 2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 • 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 • 6．取中间培养液稀释分离、培养。 • 7．挑取菌落进行筛选。

亚硝基胍诱变曲霉菌 • N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。

(二)操作步骤 • 1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。 • 2．MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。

3．诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。 • 4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。 • 5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．

第三节营养缺陷型的选育 • 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 • 与营养缺陷型对应的是野生型。

能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)； • 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)； • 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。

营养缺陷型的用途 • 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。

筛选营养缺陷型的步骤 • 诱变 • 淘汰野生型 • 检出缺陷型 • 确定生长谱

一、诱变方法 • 物理诱变 • 化学诱变

二、淘汰野生型 • 抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 • 菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

三、检出缺陷型 • 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 • 具体方法：影印法、点种法、夹层法

(一)影印法 • 1．将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。 • 2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。 • 3．将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

4．将CM和MM在恒温箱中培养。 • 5．二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于GM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。 • 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。

(二)点种法 • 也就是任意法。 • 用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。 • 此法结果明确，但工作量大。

(三)夹层法 • 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。 • 此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。

四、营养缺陷型生长谱的确定 • 验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。

生长谱测定的方法 • 将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。—个平皿测一个菌。

以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5～6个平皿上可测20株菌以上。以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5～6个平皿上可测20株菌以上。

第四节基因育种 • 基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。

一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 • １、获得待克隆的DNA片段（基因）； • ２、目的基因与载体在体外连接； • ３、重组DNA分子导入宿主细胞； • ４、筛选、鉴定阳性重组子； • ５、重组子的扩增与／或表达。

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