第二节沉淀与共沉淀分离法

第二节沉淀与共沉淀分离法

沉淀分离法 (Separation by precipitation) 一、概述二、分类三、常用的沉淀分离方法及试剂

一、概述 • 沉淀分离法是在溶液中加入溶剂或沉淀剂, 通过化学反应或者改变溶液的pH值、温度、压力等条件, 使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方法。 • 能否将分离物从溶液中析出 , 取决于分离物的溶解度或溶度积, 关键在于选择适当的沉淀剂和控制条件, 沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质, 或是将已纯化的产品由液态变成固态。

2、沉淀分离方法特点 • 沉淀法是最古老、经典的化学分离方法。虽然，沉淀分离需经过过滤、洗涤等手续，操作较繁琐费时；某些组分的沉淀分离选择性较差，分离不完全。但由于应用范围广、不需特殊设备，沉淀分离法仍然是一种常用的分离方法。

在应用沉淀分离技术时,需要考虑三种因素 ①沉淀的方法和技术应具有一定的选择性, 才能使目标成分得到较好分离,纯度较高； ②对于一些活性物质( 如酶、蛋白质等)的沉淀分离,必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏； ③对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离, 必须充分估量残留物对人体的危害.

二、沉淀分离法的分类 沉淀分离法分为：沉淀分离法和共沉淀分离法。两种方法的区别主要是：沉淀分离法主要使用于常量组分的分离（毫克数量级以上); 共沉淀分离法主要使用于痕量组分的分离(小于1mg/mL). 根据分离的对象不同，沉淀分离的方法和技术也有较大差异。因此，分为无机离子及化合物的分离和有机及生物化合物的分离两大类讨论。

三、常用的沉淀分离方法及试剂 （一）无机离子及化合物的分离 1. 氢氧化物沉淀分离 2. 硫化物沉淀分离 3. 共沉淀分离法 4. 常用无机沉淀剂 5. 常用有机沉淀剂 6. 常用无机共沉淀剂 7. 常用有机共沉淀剂

氢氧化物沉淀分离

氢氧化物沉淀分离 a.几种主要的沉淀剂及特点 (1) NaOH溶液可使两性的氢氧化物溶解而于其他氢氧化物沉淀分离。 (2) 氨水加铵盐氨水加铵盐组成的pH值为8－10，使高价离子沉淀而于一、二价的金属离子分离；另一方面Ag+, Cu2+, Co2+, Ni2+等离子因形成氨络离子留于溶液中。 (3) ZnO悬浊液ZnO为一难溶碱，用水调成悬浊液，可在氢氧化物沉淀分离中用作沉淀剂。 (4) 有机碱六亚甲基四胺、吡啶、苯胺、苯肼等有机碱，与其共轭酸组成缓冲溶液，可控制溶液的pH，使某些金属离子生成氢氧化物沉淀，达到沉淀分离的目的。

b. 氢氧化物沉淀分离的特点： 1. 金属氢氧化物沉淀的溶度积相差很大，通过控制酸度使某些金属离子相互分离。 2. 氢氧化物沉淀为胶体沉淀，共沉淀严重，影响分离效果。（1）采用“小体积”沉淀法——小体积、大浓度且有大量对测定没有干扰的盐存在下进行沉淀。如：在大量NaCl存在下，NaOH分离Al3+与Fe3+。（2）控制pH值选择合适的沉淀剂：不同金属形成氢氧化物的pH值、及介质不同。（3）采用均匀沉淀法或在较热、浓溶液中沉淀并且热溶液洗涤消除共沉淀。（4）加入掩蔽剂提高分离选择性

pM 图2.3 金属离子浓度对数图 c. 影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素（1）金属离子浓度：浓度越低，pH值就越高；

c. 影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素 （2）离子的本性：阳离子电荷越多，半径越小则极化作用越强，沉淀所需pH值较低；（3）同一周期，自左向右，阳离子电荷增加，极化作用增强，与OH-结合逐渐牢固，则阳离子沉淀时的pH值就逐渐降低。例如：Mg2+沉淀时的pH值为10.5，而Al3+则pH=4.2 （4）不同价态金属离子生成氢氧化物或水合氧化物不同。

2、硫化物沉淀分离 原理能形成难溶硫化物沉淀的金属离子约有40余种，除碱金属和碱土金属的硫化物能溶于水外，重金属离子个分别在不同的酸度下形成硫化物沉淀。因此在某些情况下，利用硫化物进行沉淀分离还是有效的。 硫化物沉淀分离法所用的主要沉淀剂是H2S。H2S是二元弱酸，溶液中的[S2-]与溶液的酸度有关，随着[H+]的增加，[S2-]迅速的降低。因此，控制溶液的pH值，即可控制[S2-]，使不同溶解度的硫化物得以分离。

沉淀剂：H2S 约40余种金属离子可生成难溶硫化物沉淀；各种金属硫化物沉淀的溶解度相差较大；根据H2S的分布曲线，溶液中S2-的浓度与pH有关，控制溶液pH 可控制分步沉淀。 H2S 有毒，气味难闻；选择性差。

2、硫化物沉淀分离的特点 （1）硫化物的溶度积相差比较大的，通过控制溶液的酸度来控制硫离子浓度，而使金属离子相互分离。（2）硫化物沉淀分离的选择性不高。（3）硫化物沉淀大多是胶体，共沉淀现象比较严重，甚至还存在继沉淀现象。可以采用硫代乙酰胺在酸性或碱性溶液中水解进行均相沉淀。在酸性溶液中： CH3CSNH2+2H2O+H+===CH3COOH+H2S+NH4+ 在碱性溶液中： CH3CSNH2+3OH-===CH3COO- + S2- +NH3 + H2O （4）适用于分离除去重金属（如Pb2+）

（二）有机试剂沉淀分离法 特点：高选择性、高灵敏度；应用普遍；有机沉淀剂与金属离子生成的三种沉淀类型： 1. 螯合物沉淀 8-羟基喹啉与Mg2+生成六元环结构的螯合物沉淀；在氨缓冲溶液中，可实现镁与碱金属及碱土金属的分离； 2. 缔合物沉淀痕量Zn2+的共沉淀； 3. 三元化合物提高选择性和灵敏度的一条途径；

四、共沉淀分离法 a 定义：共沉淀分离法就是加入某种离子同沉淀剂生成沉淀作为载体（沉淀剂，将痕量组分定量地沉淀下来，然后将沉淀分离（溶解在少量溶剂中、灼烧等方法），以达到分离和富集的目的的一种分析方法。 b 沉淀剂要求（1）要求对欲富集的痕量组分回收率高。（2）要求共沉淀剂不干扰待富集组分的测定。

1、常用无机共沉淀剂

无机共沉淀剂 1、吸附共沉淀剂吸附是在沉淀表面吸附和沉淀有共同离子的盐。 Fe(OH)3:金属Cu中分离微量的Al PbS: 富集微量的Cu2+ 2、混晶共沉淀剂两种化合物的晶型相同，离子半径相差在10%-15%以内产生混晶。钢中的铍，可以利用BaSO4形成混晶富集。 SrSO4生成混晶以富集食物中的痕量Pb2+，Fe3+、Cd2+、Co2+等离子不干扰。（选择性好） 3、形成晶核的共沉淀剂（极微量离子） 4、沉淀的转化作用（溶液中微量的Cu2+，CdS滤纸)

2、常用有机共沉淀剂

有机及生物化合物的分离 1. 溶剂沉淀 2. 盐析沉淀 3.沉淀剂沉淀

1、溶剂沉淀 溶剂沉淀在有机化合物( 如蛋白质、酶、多糖、核酸等) 水溶液中加入有机溶剂( 如乙醇、丙酮等) 后 , 显著降低待分离物质的溶解度从而将其沉淀析出的一种方法。机理在于溶质 ( 待分离物质) 在溶液中化学势发生变化造成溶解度的下降。优点在于选择性好、分辨率高, 因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀 , 溶剂易除去易回收 , 但条件控制不当容易使待分离物质( 如蛋白质) 变性。

1). 溶剂的选择及其添加量 选择合适的溶剂是溶剂沉淀的关键, 溶剂必须是能与水相混溶的有机溶剂, 如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、石油醚、二甲基亚砜、己烷、四氢呋喃等。其中乙醇最为常用, 能沉淀蛋白质、核酸、核苷酸、多糖、果胶和氨基酸等化合物, 且安全性最高。同时, 不同的有机化合物沉淀所需要的溶剂浓度有不同要求, 使用不同浓度的同一种溶剂, 往往可以在混合溶液中起到分级沉淀的效果。

2). 样品浓度的确定 对于蛋白质样品溶液的沉淀分离, 如果样品浓度低一些, 可以减少蛋白质之间的相互作用, 防止共沉淀现象, 但易引起蛋白变性, 另一方面, 如果样品浓度高一些, 可以减少蛋白变性, 有机溶剂的使用量也可减少, 但控制不当易出现共沉淀现象, 一般而言, 控制蛋白质起始浓度为5-0mg/mL 。

3).温度的调节 对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离, 一般在低温条件下进行,大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而降低, 可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。如果温度过高, 促使蛋白质的分子结构松散, 使得溶剂分子与一些氨基酸残基产生疏水性结合而引起蛋白质的不可逆变性。

4). pH 值的调节 蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH值影响 , 一般在等电点的溶解度最低, 将pH值调节到溶液中多数蛋白质带有相同的净电荷, 可减少蛋白质之间的相互作用, 防止共沉淀。利用改变溶液的pH值可实现有选择的分段沉淀, 另外, pH值与离子强度有协同作用而改变蛋白质的溶解度。

5). 离子强度的调节 低浓度的中性盐类增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 , 并且对蛋白质具有保护作用, 防止变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需要更高的溶剂浓度。

2. 盐析沉淀 在较低浓度的盐溶液中, 酶和蛋白质的溶解度随盐浓度升高而增大 , 这称之为盐溶; 当盐浓度增大至一定程度后 , 酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出, 这称之为盐析。原理在于中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团及水活度的影响结果。

蛋白质分子的表面特性 蛋白质是两性高分子电解质，由疏水性不同的20多种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。但是，仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成硫水区。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和硫水区构成。

产生“盐析” （Salting out）的原因 • 盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合，形成离子对，使其分子之间电排斥作用减弱而相互聚集，靠拢。 • 中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区，由于疏水区的相互作用，使其沉淀。

纯一单蛋白质有公式：lg S = β－kS×I S为蛋白质溶解度（g/L）； β　为I=0时lg S，它取决于溶质的性质； kS为盐析常数，主要决定于加入盐的性　　　　质及Pr性质。 I　为盐离子强度（mol/L）

盐析的讨论 • ㈠. 单一纯蛋白质的盐析 1．在一定的pH和温度下，改变离子强度－ kS盐析法　　盐、Pr一定， kS值一定，I↑则 S↓ 2．在一定的离子强度下，改变pH和温度－ β盐析法 β—pH：在Pr 的pI时其溶解度较小 β—温度：在保证Pr不变性下，温度↑ β↓ 利于盐析。 3．原始浓度P P小盐析所需I高，P大盐析所需I低　对混合Pr的盐析，P大，会发生严重共沉作　　　　用，一般控制浓度为 2.5-3%。

㈡. 混合Pr的盐析 1．合适盐析范围的选择：不同Pr盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。 2．改变原始浓度：一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化。 3．二次盐析：在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。

盐析操作要点 • 1．盐的种类及选择可使用的中性盐有：(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaCl NaAc、 Na3PO4柠檬酸钠和硫氰化钾等， (NH4)2SO4、Na2SO4最广泛，前者最受欢迎 • 2．盐析范围的确定可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑） • 3．盐的加入方式固体缓慢加，防泡沫，要平衡。液体（饱和盐溶液）要求盐析范围小于50%饱和度取一份小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围 • 4. Pr的原始浓度太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对Pr回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉。

盐析操作的其他方法 • 1．透析盐析将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使Pr↓ 2．反抽提法（Back-Extraction）将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。

影响盐析的因素 1. 溶质（蛋白质等）种类不同溶质的kS和β均不相同，所需的离子强度也不同。 2. 溶质（蛋白质等）浓度蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量少，蛋白质溶解损失小；蛋白质浓度较小时，情况相反。一般蛋白质浓度控制在2-3％为宜 3. pH 等电点附近，用盐量少，蛋白质收率高。 4. 温度温度升高，溶解度升高；多数蛋白质在高盐浓度下，其溶解度反而下降，胃蛋白酶，大豆球蛋白例外。

蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种: 1. 在固定蛋白质溶液的pH 值与温度的前提下, 添加盐来调节溶液离子强度以达到沉淀蛋白质的目的。此法常用于蛋白质粗制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。 2. 在一定的离子强度下, 调节溶液的pH值或温度以达到沉淀蛋白质的目的, 此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。影响盐析效果的因素有蛋白质的浓度、盐类、离子类型、离子浓度、pH 值、温度等.

盐析沉淀条件中 , 中性盐的合理选择至关重要 , 根据离子促变序列, 多价盐类的盐析效果比单价的效果好, 阴离子的效果比阳离子的好。顺序大致如下 : 柠檬酸根 > 酒石酸根 > PO43- > F- > I03- > SO42- > 醋酸根 > B2O3- > Cl- > Cl03- > Br- > N03- > ClO4- > I- > SCN-；Th4+ > A13+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ ；Mg2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+。

在蛋白质溶液中 , 一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广 , 选择中性盐时注意添加盐的纯度 , 避免杂质带来干扰或对蛋白质的毒害。使用带金属离子的盐类时 , 可考虑添加一定量的金属整合剂如EDTA 等。蛋白质或酶等物质经盐析沉淀分离后 , 产品夹带盐分, 需脱盐处理。常用的脱盐处理方法有透析法、超滤法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。

3. 沉淀剂沉淀 添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物，从而从溶液中沉淀析出的方法 , 称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法,酸类及阴离子沉淀法,非离子型聚合物沉淀法以及均相沉淀法等。

1). 金属离子沉淀法 蛋白质在碱性溶液中带负电, 金属离子与蛋白质中的-COOH、-OH、-NH2、 -SH 等基团反应生成难溶性的复合盐而析出。根据金属离子与蛋白质的相互作用关系, 将金属离子分成以下三类。 (1) 与羧基、氨基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子有：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+等。 (2) 与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子有:Ca2+、Mg2+、Pb2+和 Ba2+等。 (3) 与巯基化合物强烈结合的金属离子有:Hg+、Ag+和Pb2+等。

金属离子沉淀分离效果除与金属离子的种类、蛋白质的性质、离子化程度以及相互结合的位置等因素有关, 沉淀的复合物的溶解度与溶液的介电常数相关, 介电常数减小则溶解度降低。一般而言, 金属离子浓度调节在0.02mol/L 左右。浓度过高, 易引起共沉淀, 并且产生的静电力可能影响蛋白质的二、三、四级空间结构, 引起蛋白质变性。复合物中金属离子的去除, 可通人H2S形成硫化物去除或添加鳌合剂EDTA 。金属离子沉淀法常有共沉淀现象和吸附作用, 同时有一些金属盐的溶解度相对也比较大, 因此分离效果受到影响, 实践中一般用作初步分离, 并且通常是与其他分离方法配合使用。

2). 酸沉淀法 一些含氮的有机酸如苦酸、苦酮酸和鞣酸等能与有机分子的碱性基团反应生成难溶性的盐复合物析出, 但这种盐复合物沉淀往往是属于不可逆反应, 引起蛋白质发生变性, 因此, 需要采取预防蛋白质变性的措施, 如采用温和的反应条件, 并加入一定量的稳定剂 ( 如抗坏血酸等) 。许多元机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀, 如磷钨酸、砷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷、砷、硼、硅的钼酸或钒酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由乙醚萃取出来。

3). 非离子型聚合物沉淀法 一些非离子型多聚物 ( 如聚乙二醇、壬苯乙烯化氧、葡聚糖和右旋糖酐硫酸钠等) 作为沉淀剂 , 能将溶液的一些有机物质沉淀分离出来 , 如蛋白质、酶、核酸、细菌、病毒等

非离子型聚合物沉淀法的特点 非离子型聚合物沉淀法操作条件温和, 不易引起生物分子的变性, 少量的沉淀剂就能沉淀大量的生物大分子物质,并且沉淀后的多聚物容易除去。聚乙二醇(PEG) 是应用较多的水溶性的非离子型多聚物, 多用于沉淀蛋白质, 其沉淀效果除与溶液的离子强度、pH值、温度及蛋白质浓度等因素有关之外 , 还与沉淀剂本身的分子量及浓度有关, 一般而言, 聚乙二醇浓度与溶液的离子强度成反比。当pH值越接近蛋白质等电点, 所需PEG浓度也越低。同时在一定范围内, PEG的相对分子质量越大沉淀效果越好。

4. 均相沉淀法 直接将沉淀剂加入溶液中 , 容易出现局部浓度过度 , 产生的沉淀物过于细小或者结构疏松 , 均匀不一 , 易吸附杂质影响纯度 , 而借助于化学反应使溶液中缓慢而均匀地产生沉淀剂以获得较纯净的晶形或非晶形沉淀, 这就是均相沉淀法。

影响沉淀类型和性状的因素 • 定向速率：沉淀物质本性决定 • 聚集速率：决定于沉淀的相对过饱和度 Q: 加入沉淀剂瞬间生成沉淀的浓度 S:沉淀的溶解度 K：比例常数

实现均相沉淀的手段 (1) 在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂, 使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。 (2) 利用某种试剂的水解反应使溶液的pH值发生变化, 使pH 值达到一定值时就会生成沉淀。 (3) 将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合, 再缓慢蒸去溶剂, 使之在缓冲条件下实现均相沉淀。 (4) 破坏可溶性络合物。

5.等电点沉淀分离法 等电点沉淀分离法主要是利用两性电解质分子在电中性时溶解度最低 , 不同的两性电解质具有不同的等电点而进行分离的一种方法。如蛋白质、酶以及氨基酸等两性电解质, 当其整体电荷为中性时, 溶解度最小, 控制不同的等电点 , 就能将不同的电解质分离。

6. 变性沉淀法 变性沉淀是利用生物大分子( 如蛋白质) 在变性后溶解度降低而从溶液中沉淀析出 , 当然轻度变性的蛋白质不一定沉淀出来, 变性后蛋白质能恢复原来结构与功能的过程称为可逆变性, 反之称为不可逆变性。引起蛋白质变性的因素包括温度、pH 值以及其他的化学因素, 能引起蛋白质变性的化学试剂有甲酸、乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等酸类; 甲醇、乙醇、甘油等醇类；甲酰胺、N-甲基乙酰胺等酰胺类; 以及二脲、盐酸胍、氯仿、酚等, 还有表面活性剂如十二烷基磺酸钠(SDS) 等 , 另外 , 一些酶也会使蛋白质变性。

第 二节 沉淀与共沉淀分离法