1 / 29

Análise por marcadores moleculares

Análise por marcadores moleculares. Prof. Vinicius Campos. Genética. 1900s - Descoberta dos princípios genéticos 1920-50 - Melhoramento genético científico genética quantitativa e biometria (fenótipo é previsor ruim do valor genético!)

gabby
Download Presentation

Análise por marcadores moleculares

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Análise por marcadores moleculares Prof. Vinicius Campos

  2. Genética • 1900s - Descoberta dos princípios genéticos • 1920-50 - Melhoramento genético científico • genética quantitativa e biometria • (fenótipo é previsor ruim do valor genético!) • 1970-80 - Utilização de marcadores genéticos moleculares

  3. Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples marcadores cromossoma

  4. Polimorfismo de DNA pontual ou inserção/deleção macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções

  5. Origem do Polimorfismo Molecular • Mutaçõespontuais– SNPs • A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA • TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT • B. ATCTCGTGATTATAGTCGTA • TAGAGCACTAATATCAGCAT • 2. Pequenasdeleções e/ouinserções - InDels • A. ATCTCGTCTAGTCGTA • TAGAGCAGATCAGCAT • B. ATCTCGT---GTCGTA • TAGAGCA---CAGCAT

  6. Classes de Marcadores Principais Marcadores na Indústria Animal • Polimorfismos Tipo SNP - RFLP • Polimorfismos Tipo RAPD • Marcadores Microssatélites

  7. Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP • Polimorfismo de tamanho de fragmento • RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos • Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção • Utiliza-se DNA celular total

  8. Como funciona

  9. Herança

  10. RFLP - Procedimento Extração de DNA A amostra de DNA é amplificada por PCR Digestão enzimática dos produtos de PCR com enzima de restrição adequada e à sua temperatura ótima Utilizam-se controles normais e se disponíveis controlos homozigóticos e heterozigóticos para a mutação Os produtos da digestão são colocados nos poços de um gel de agarose ou de poliacrilamida

  11. RFLP - Análise

  12. RFLP Eletroforese da digestão enzimática com MscI e FauI para pesquisa da mutação L858R

  13. Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD • Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários • 10 bases com >50% G+C • PCR com um único primer • Método rápido para detecção de polimorfismos • Marcador dominante • Problemas de reproducibilidade

  14. RAPD AA AA Aa aa Aa aa

  15. Interpretação de RAPDs • Marcadores RAPD são anônimos • Dados binários (presença x ausência) • RAPD são dominantes (AA = Aa) • Problemas de co-migração • mesma banda, mesmo fragmento? • uma banda, um fragmento? • Questionamento para filogenia • banda homólogas?

  16. PCR com primers arbitrários: acúmulo de siglas! • RAPD • RandomAmplifiedPolymorphic DNA • DAF • DNA AmplificationFingerprinting • AP-PCR • ArbitrarilyPrimedPolymerase Chain Reaction • MAAP • MultipleArbitraryAmpliconProfiling (sugerido por incluir todas as pequenas variações na técnica)

  17. Diferenças entre ensaios com primers arbitrários • RAPD • 10mers, gel de agarose corado com brometo • DAF • 5mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P • AP-PCR • 10mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P

  18. GEL RAPD

  19. RAPD - resumo • Rápido • Simples • Baixo custo • Sem uso de radio-isótopos • Marcador dominante • Problemas de reproducibilidade • Problemas de interpretação

  20. Microssatélites • Sequence-TaggedMicrosatélites (STMS) • também conhecido como microssatélite ou SimpleSequenceRepeat(SSR) • Normalmente locus simples e multi-alélico • Co-dominante • Altamente reprodutível

  21. Microssatélites • Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas em tandem • Presentes em procariotos e eucariotos • Presentes em regiões codificantes e não codificantes • Maioria das repetições são dinucleotídeos • (AC) n (AG) n (AT)n

  22. Microssatélites • Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições • Escorregamento da DNA polimerase durante a replicação • Crossing-over desigual entre cromátides irmãs • Codominantes • Normalmente locos simples e multi-alélico

  23. Microssatélites • altamente informativo - vários alelos por locos • detecção por PCR • facilmente transferível entre labs • distribuição homogênea no genoma

  24. Microssatélites Primer FOR NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCACACACACACACACACACNNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTGTGTGNNNNNNNNNNNNNN Repetição CA Primer REV

  25. Microssatélites Obtenção de seqüências: • a partir de banco de dados de genoma ou cDNA • hibridação com biblioteca genômica, identificação de clones e seqüenciamento • construção de biblioteca enriquecida por afinidade com seqüência da matriz

  26. Microssatélites • Detecção do polimorfismo • Géis de agarose • Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 2pb) • coloração direta: nitrato de prata (barato) • Coloração indireta: marcação radioativa ou fluorescente

  27. Análise Microssatélites

  28. Microssatélites • Problemas • Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos primers • Construção de bibliotecas genômica • sequenciamento • Triagem dos melhores primers Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados EST (ExpressedSequenceTags) - SSR funcional x SSR genômico

  29. Comparação entre Marcadores

More Related