1 / 13

酵母菌内 烃类合成途径的构建

酵母菌内 烃类合成途径的构建. 报告人：张文倩. 背景. 目标：实现以 C11 ， C12 为主要成分的中链烃类（ C8-C14 ）的生物合成. 脂酰 CoA. 葡萄糖. 脂酰 CoA 水解酶（ 硫酯酶） C8-16. （人，小鼠）. 自由脂肪酸. 丙酮酸. α- 双加氧酶 C10-16. （大米）. 乙酰辅酶 A. 脂肪醛. 脂肪醛脱羰酶 C14-18. （蓝细菌）. ACC. 丙二酰辅酶 A. 烷烃. 脂酰 CoA 硫酯酶.

freya
Download Presentation

酵母菌内 烃类合成途径的构建

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 酵母菌内烃类合成途径的构建 报告人：张文倩

  2. 背景 目标：实现以C11，C12为主要成分的中链烃类（C8-C14）的生物合成

  3. 脂酰CoA 葡萄糖 脂酰CoA水解酶（硫酯酶） C8-16 （人，小鼠） 自由脂肪酸 丙酮酸 α-双加氧酶 C10-16 （大米） 乙酰辅酶A 脂肪醛 脂肪醛脱羰酶C14-18 （蓝细菌） ACC 丙二酰辅酶A 烷烃

  4. 脂酰CoA硫酯酶 选取小鼠和人各一个基因命名为H1，H2，已经合成回来，连接在pUC18上。现H2已经连接到pYES2.0上。正在进行酵母转化

  5. α-双加氧酶 -

  6. 十五醛 C10-C16脂肪酸 十三醛 十一醛 C9-C 15脂肪醛 壬醛 Assumption: α-dioxygenase only accepts long- and middle-chain fatty acids with a carbon chain of at least ten carbon atoms as substrates

  7. 脂肪醛脱羰酶 ORF1594 蓝细菌中产烃体系 PCC7942中的ORF 1594 和ORF 1593 ORF 1593

  8. C14-C18醛 Require O2 Require a reducing system： NADPH and ferredoxin and ferredoxinreductase C13-C17烃

  9. 基础工作:基因的连接导入 脂酰CoA 脂酰CoA水解酶 H1, H2 自由脂肪酸 • HI,H2, 导入pYES2.0（含诱导性启动子GAL1），在酵母中进行单表达 • 合成α-DOX（设计酶切位点） • 将α-DOX 和R2分别导入pYES2.0 ，分别采用不同强度的组合型启动子进行组合优化，进行单表达 启动子强度：TEF1>TDH3>PGK1>TDH1 • 将三个基因一起连接到同一pYES2.0上，实现共表达（均选取表达效果较好的启动子） α-DOX α-双加氧酶 脂肪醛 R2 脂肪醛脱羰酶 中链烃（Jet Fuel） C7-15；C11

  10. 工作方向 1 体内外检测酶活的方法 体内：将单个基因HI,H2 ,α-DOX ,R2分别导入pYES2.0，在酿酒酵母中进行单表达，酶利用细胞自身的底物生成对应产物，通过检测产物含量验证酶活。（色谱） 体外：需根据具体反应所需的条件（如是否需氧，是否需要还原体系等）构建酶活反应体系，进而提供相应底物，通过产物含量检测酶活。

  11. 2 内源ACC启动子替换具体方案 已经要到PWJ1042质粒，可以进行URA3的同源臂替换，最终将ACC的原有启动子替换为其他强度较大的启动子如TEF1。

  12. 3耶氏解脂酵母相关资料的查阅（索要整合型与游离型质粒，可用启动子）3耶氏解脂酵母相关资料的查阅（索要整合型与游离型质粒，可用启动子） 4着丝粒质粒（比普通游离型质粒稳定，拷贝数低） 目前有三种营养标记型。 将基因导入着丝粒质粒中，试验其表达效果

  13. Thank you!

More Related