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禽流感的实验室诊断

禽流感的实验室诊断. 第八组. 什么是禽流感 ?. 禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒） 引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病. 高致病性禽流感 H5N1: 最严重，发病率高，死亡率高 . 低致病性禽流感 H9N2/H7N7 ：呼吸道症状轻，食量减少，产蛋量下降 , 零星死亡 . 非致病性禽流感 ：无症状， 仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。. 禽流感病毒图解.

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禽流感的实验室诊断

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Presentation Transcript

  1. 禽流感的实验室诊断 第八组

  2. 什么是禽流感? 禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒） 引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病.

  3. 高致病性禽流感H5N1:最严重，发病率高，死亡率高. • 低致病性禽流感H9N2/H7N7 ：呼吸道症状轻，食量减少，产蛋量下降,零星死亡. • 非致病性禽流感 ：无症状， 仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。

  4. 禽流感病毒图解

  5. 由A型流感病毒引起的禽流感，其临床症状因感染禽的年龄、种类、饲养管理水平、并发感染情况及新感染毒株的毒力等不同而表现不一致。其病理变化因感染病毒株毒力的高低、病程的长短及种类不同也不尽相同。因此，禽流感的诊断一直依赖于病原的分离鉴定，OIE也一直采取的是进行病毒分离鉴定这个黄金标准。随着血清学实验技术和生物工程技术的飞速发展，禽流感诊断技术的研究也取得了新的进展。

  6. 对于禽流感传统的病原学诊断方法是用鸡胚或者狗肾细胞(MDCK)、鸡胚成纤维细胞(CEF)等进行病毒分离，采用血凝和血凝抑制进行鉴定，血清学的诊断方法则包括中和试验和琼脂扩散试验等。

  7. 近年来，随着免疫学和分子生物学技术的飞速发展，禽流感的诊断技术也越来越完善，现在已经有免疫印迹、免疫荧光、ELISA、墓因芯片、RT-PCR技术、荧光RT-PCR技术、NASBA技术等。

  8. 如果要检验是否是高致病性禽流感病毒，在进行HA亚型鉴定之后，还需要进行细胞培养、动物试验或进行裂解位点的序列分析等进行判断。如果要检验是否是高致病性禽流感病毒，在进行HA亚型鉴定之后，还需要进行细胞培养、动物试验或进行裂解位点的序列分析等进行判断。

  9. OIE判断HPAIV的标准是： • ①含流感病毒尿囊液，做l：10稀释，静脉内接种8只4～8周龄易感鸡，每只0．2ml，如在10天内死亡6只以上，则该流感病毒为HPAIV~ • ②如果致死l一5只易感鸡，而且又不是H5或H7亚型，则将其接种鸡胚成纤维细胞(CEF)或MDCK细胞，在没有胰酶的情况下观察是否产生细胞病理变化，如不产生病理变化，该流感病毒就不是HPAIV； • ③对于所有的低致病性H5和H7亚型病毒和其他流感病毒，如果在没有胰酶的条件下在细胞培养能生长，则必须测定血凝素裂解部位的氨基酸顺序，如果相似于其他的HPAIV，存在多个碱性氨基酸序列，则该受检病毒被视为高致病性。

  10. 1．样品采集 • 样品采集的质量是进行禽流感检测的关键。应从死禽和处于急性发病期的病禽采集样品，样品要具有典型性。采样过程要注意无菌操作，同时避免污染环境。采样人员要按NY／丁7(38要求加强个人防护。样品的保存和运输也要按照有关的规定和要求进行。

  11. (1)病料样品  至少从5只病禽和病死禽中采集病料样品(发病群不足5只则全部采样)。样品应包括：泄殖腔(新鲜粪尿样)棉拭子和气管棉拭子(置于缓冲液中)；气管和肺的混样；肠管及内容物的混样；肝、脾、肾和脑等其他组织样品(不能混样)。 •     组织样品、气管棉拭子单独放人容器，容器中盛放含有抗生素(pH值为7．0～7．4)的PBS液。抗生素的选择应视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中加入青霉素(20001U／ml)、链霉素(2mg／ml)或庆大霉素(50t~g／m1)。肠管及内容物、粪便样品和泄殖腔棉拭子所用的抗生素浓度应提高5倍(加入抗生素后PBS液的pH值应调至7．0-7．4)。

  12. 2)血样 分别采集至少10个病禽的(急性发病期血清，如发病群不足10只则全部采样)，并要求单独存放，不能混合。

  13. 2．病毒的分离鉴定 • 以无菌拭子采集气管或泄殖腔病料或病变组织，研磨制成10％悬液，经处理后接种9-11日龄SPF鸡胚，收获尿囊液测定血凝活性，若为阴性则应继续盲传2～3代。对具有血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI试验，以排除新城疫的可能，即使ND阳性也应采用中和法继续传代，看是否为ND与AIV混合感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异性核心抗原NP或MP，然后用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时，进行致病力试验，确定毒力的强弱。

  14. 鸡胚培养法的优点 鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒；鸡胚是个整体，有神经血管的分布及脏器的构造；来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。3天可报告结果。病毒分离鉴定对AI的诊断比较确实，但操作程序繁杂，费用高，耗时费力。

  15. 免疫荧光技术(IFT)诊断禽流感 • 免疫荧光技术就是荧光抗体技术(FAT)。IFT最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞中特异性抗原，主要是核内荧光。用M1抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光。

  16. IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断，1984年宾夕法尼亚州暴发禽流感时Skeeles将IFT首次用于AIV的检测。用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法，即在组织触片上直接染色、以荧光显微镜检查荧光。一种AIV的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。IFT用于禽流感的诊断具有快速、简便和敏感性好的特点，而且检测成本费用相对较低，其敏感度与病毒的分离鉴定相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避免和降低标本中出现的假阳性(即非特异性荧光)问题。

  17. 对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体进行检测时，发现间接固相免疫荧光技术的敏感性比HI高40～150倍。间接免疫荧光技术也可以用来检测核蛋白(N尸)和基质蛋白(M1)抗原与抗体的反应，其敏感性很高。该反应对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒进行裂解。

  18. 由于单克隆抗体的问世，大大提高了免疫荧光测定的效果。免疫荧光用于禽流感的诊断具有快速(2h之内)、特异和敏感性高的特点，但是其不能鉴别HA和NA亚型，而且需要特殊的设备(荧光显微镜)，且工作人员需具有一定的经验，所以在基层检测单位推广应用具有一定的局限性。

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