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血液 DNA 提取及 PCR 扩增

分子流行病学实验. 血液 DNA 提取及 PCR 扩增. DNA 提取. 经典 DNA 提取法 1. 在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。 2. 去垢剂（ SDS ）与蛋白酶消化蛋白，分离 DNA 。 3. 有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取 DNA 。 4. 乙醇与盐类沉淀 DNA 。. DNA 提取 基本步骤. 1. 样品处理：分离细胞，低渗盐水（ 0.2% ）或细胞悬浮液。（ 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml 胰 RNA 酶 ,0.5%SDS ）。

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血液 DNA 提取及 PCR 扩增

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Presentation Transcript

  1. 分子流行病学实验 血液DNA提取及PCR扩增

  2. DNA提取 经典DNA提取法 1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。 2.去垢剂（SDS）与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3.有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取DNA。 4.乙醇与盐类沉淀DNA。

  3. DNA提取基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。（10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS）。 2.消 化：TNE缓冲液 （15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白酶K（终浓度，100μg/ml），混匀，50℃3h，45℃过夜。 3.DNA 分离：等体积饱和酚；等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）；氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min。 4.沉淀 DNA：1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。离心，挥干。可加醋酸钠（终浓度：0.3mol/L）并低温。10-20分钟。 5.溶解DNA：适量TE（10mmol/L Tris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA）,长时间。

  4. DNA提取其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基苯 共聚物。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200μl；56℃0.5h以上；100℃8min；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性），二氧化硅（硅珠，核酸吸附）。 基本方法：血液（1-4μl）TES（100μl）SDS（20μl）煮沸5min；300μl GuSCN溶液与20μl硅珠液保温15 min；离心后加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗；TES56℃10 min离心取上清。 3.直接煮沸法 100℃10min

  5. DNA提取注意事项 1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2.消化时间宜长不宜短。 3.操作轻柔。 4.混匀要充分。 5.挥干不宜过度。

  6. DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法：参照标准分析。 2.分光光度计分析 基本原理：260nm波长为核酸吸收峰，1OD值为50μg/μl双链核酸（40μg/μl单链核酸），根据OD值可计算DNA含量。 计算方法：DNA浓度（μg/μl）=OD×50×稀释倍数÷1000 例：40倍稀释液，OD值为1.7 DNA浓度=1.7×50×40÷1000=3.4μg/μl 280nm波长为蛋白吸收峰，260/280比检测核酸纯度。1.6-1.8 （八）DNA纯化

  7. 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：在模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。100万倍，由数pg-数μg。

  8. PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94℃左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。 2.退火/复性（annealing）：在降温的条件下（55℃-62℃），引物与其互补的模板DNA片段（靶片段的側翼序列）结合形成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合适的温度下（68℃-72℃），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸，由引物的3ˊ端为起始点，从5ˊ向3ˊ端延伸，合成新的与DNA 靶片段互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2×105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。

  9. PCR反应的体系 标准体系为50-100μl，常用20μl。 DNA模板10-50ng DNA聚合酶0.5-1.0U 一对引物0.1-0.5μmol/L 4种脱氧核苷酸40μmol/L 缓冲液 反应条件：95℃4-5min,94℃50s/55℃-62℃30-60s/72℃30-60s,30各循环后72℃5-10min。

  10. 1.熟练掌握从外周血快速提取基因组DNA的方法；1.熟练掌握从外周血快速提取基因组DNA的方法； 2.理解PCR的原理，了解PCR操作过程； 3.熟悉琼脂糖凝胶电泳的实验过程。 目的：

  11. KI 0.9%NaCl 异丙醇 乙醇 Eppendorf管 微量加样器等 试剂及仪器：

  12. 外周血基因组DNA的提取 1、取抗凝血100μl 2、加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟 3、加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒; 4、0.9%NaCl 100μl,振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟 5、吸上清100μl加异丙醇100μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟 6、加冷无水乙醇500μl，10 000r/分钟离心5分钟 7、弃去无水乙醇，自然干燥；50μl无菌重蒸水，混匀溶解备用。 实验步骤：

  13. （1）制作PCR反应MIX （2）PCR循环扩增程序：94℃ 30s → 65℃ 30s → 72℃ 60s，循环35次，最后在72℃ 保温10min。 （3）结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 （4）PCR的电泳检测：直接取10μl电泳检测。 PCR

  14. 取10μl的PCR产物与DNA Ladder Marker进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析结果采用紫外灯照相。 电泳检测

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