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实验十 DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离. DNA fragment recovery from the agrose gel. 一.实验目的及背景. 在生物技术实验中,PCR反应获得的目的片段,酶切后所得特定的DNA序列, 分子杂交中所制备的探针等,经过琼脂糖凝胶电泳后,目的片段与其它DNA分开, 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来,通过处理后得到纯化的目的DNA, 以用于以后分子杂交,重组子构建,序列分析等. 从凝胶中分离回收DNA的方法. 现在常用的技术有: 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法等
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实验十 DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel
一.实验目的及背景 • 在生物技术实验中,PCR反应获得的目的片段,酶切后所得特定的DNA序列, 分子杂交中所制备的探针等,经过琼脂糖凝胶电泳后,目的片段与其它DNA分开, 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来,通过处理后得到纯化的目的DNA, 以用于以后分子杂交,重组子构建,序列分析等.
从凝胶中分离回收DNA的方法 现在常用的技术有: • 电洗脱法 • 低熔点琼脂糖凝胶法 • DEAE滤膜插片法等 • 其中电洗脱法,经济节省,操作方便, 对DNA的回收效果好。
低熔点琼脂糖凝胶法 • 65oC琼脂糖凝胶熔点 • 低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体
DEAE滤膜插片法 • High efficient • DNA high quality for microinjection • <5kb fragment • 100ng DNA fragment • 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes • 0.5 mol/L NaOH 5 minutes • 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) • 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
电洗脱法基本原理 • 将电泳分离后含目的DNA片段的琼脂糖切割下来, 装于透析袋中,继续在高电压下电泳,这时目的DNA会从凝胶中电泳出进入透析袋中, 由于DNA分子量大,不能透过透析袋,从而保留于透析袋中。 • 取出透析袋中含DNA的溶液, 进一步用酚、氯仿抽提纯化。
二.实验试剂及仪器 • NaHCO3 2% • EDTA-Na2 0.01M • TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋TE 酚 氯仿 乙醇
三、实验方法 • 一、透析袋的处理: • 1.切取适当长度适析袋。 • 2.在2%NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分钟。 • 3.弃去煮沸液,加无菌水内外反复洗净透析袋。
二、电洗脱 • 1.在长波紫外灯下(300-360nm )将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中。 • 2.向透析袋内加入2ml电泳缓冲液,使之浸没凝胶,并排空汽泡。 • 3.将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行), 加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)。 • 4.接通电源,150伏电洗,在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶。 • 5.改变电场方向继续通电1分钟。 • 6.从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中。
7.加入1.5倍体积正丁醇,混匀抽提去EB。7.加入1.5倍体积正丁醇,混匀抽提去EB。 • 8.在台式离心机上最高速2分钟。 • 9.吸去上层,正丁醇溶液。 • 10.重复7,8,9二次。 • 11.自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次。 • 12.上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc 2倍体积预冷无水乙醇,于20℃过夜。
13.12000g,4℃下离心10分钟,得DNA沉淀。13.12000g,4℃下离心10分钟,得DNA沉淀。 • 14.弃上清,加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇。 • 15.加入50μl TE溶解DNA。 • 16.取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8%琼脂糖上, 40伏电泳,3小时。 • 17.在紫外透射仪上观察结果。 • 18.测定DNA溶液OD260,OD280值。
结果与分析 • 1.计算DNA回收效率,判断DNA纯度。 • 2.记录电泳结果 • 问题与讨论: • 1.电洗脱过程后,为什么要反向电泳1分钟? • 2.电洗脱后的DNA如何去除EB?
玻璃奶法快速纯化回收DNA片段 本方法有多种用途,主要包括: • 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段; • 从DNA反应物中纯化目的DNA片段,如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段; • 从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段(比如引物); • DNA浓缩、去盐及去除杂质。 • 本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒,能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA(双链或单链,线性、环状或超螺旋),不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。
使用本法回收DNA片段有以下优点: • 高纯度:回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子,可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等; • 简便:所需主要仪器是一架台式离心机; • 快速:整个回收过程只需半个小时; • 高效:回收得率达到70%以上; • 多用途:可以同时作胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等; • 安全:不接触苯酚、氯仿等有害物质。
二、试剂盒组成 • 1.碘化钠溶液: 50ml • 2.DNA洗涤液(20倍浓缩液):10ml • 3.“基因纯”试剂: 1ml • 4.超纯水: 1ml • 使用前,将DNA洗涤浓缩液(10ml)倒入一玻璃瓶中,加140ml无水乙醇及50ml蒸馏水(由使用者自配),混匀后置于-20℃冰箱中,其余溶液置于4℃冰箱。
三、操作步骤 • 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段 • a. 常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭(EB)染色DNA,而后将欲分离的DNA带从胶上切割下来,置于一1.5ml离心管中。 • b. 称出凝胶带的重量,加入三倍量(V/W)的碘化钠溶液。(如0.1g凝胶中加入0.3ml碘化钠溶液)。 • c. 置于55℃水浴5-10分钟,直至凝胶完全溶化。 • d. 加入20ul充分混匀的“基因纯”试剂(建议使用前用漩涡振荡器振荡3分钟),室温放置5分钟(期间不时将管子颠倒几次以混匀)。
e. 离心10秒(10,000rpm),倒去上清液。 • f. 加0.8ml刚从冰箱中取出的DNA洗涤液,充分摇匀,离心10秒,去上清。 • g. 重复步骤f两次(共洗涤三次)。 • h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。 • i. 加入20ul超纯水,混匀后置于55℃水浴5分钟。 • j. 离心3分钟,将上清液小心吸至另一个离心管,即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。
注意事项: • 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏,故尽量放置于暗室,切带时应使用长波长紫外灯,切胶时间尽量短。 • DNA洗涤液应保持在低温,否则可能使DNA从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。 • 步骤h是另一关键,管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去,可能导致“基因纯”试剂上结合的DNA无法由蒸馏水洗脱。
PCR反应物中纯化目的DNA片段 • PCR反应完毕后,加蒸馏水至100ul(最后体积)。 • 加入300ul碘化钠溶液,混匀。 • 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。
从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段 • 探针制备反应完毕后,加蒸馏水至100ul(最后体积)。 • 加入300ul碘化钠溶液,混匀。 • 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。
DNA浓缩,去盐及去除杂质 • 加入3倍量的碘化钠溶液于样品DNA溶液中(若DNA为固态,则先将之溶于适量水或TE中,再加3倍体积的碘化钠溶液)。 • 加20ul或更多的“基因纯”试剂(每ul该试剂可吸附0.3ugDNA,操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量,但不应少于10ul)。 • 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。