二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究

1. 二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究 姓名：陈裕富 专业：应用化学A 导师：谢天尧 副教授

3. 一、前言 1.毛细管电泳技术的介绍 • 毛细管电泳（Capillary Electrophesis, CE）是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现高效、快速分离的电泳分离分析方法。 • 特点：快速、低耗、简便、高效环境友好、经济、自动、洁净

4. 毛细管电泳的分离模式： • 毛细管区带电泳(CZE） • 胶束电动毛细管色谱（MECC） • 毛细管凝胶电泳（CGE） • 毛细管等电聚焦（CIEF） • 毛细管等速电泳（CITP） • 毛细管电色谱（CEC） • 其他模式 (ACE、 CAE、CCE)

5. 毛细管电泳的检测技术： • 紫外检测（UV） • 激光诱导荧光检测器 （LIF） • 质谱检测器（MS） • 电化学检测器（EC）:电导检测、电位检测、安培检测 • 化学发光检测器（CL）

6. 2.氨基酸手性分离的研究进展 • 氨基酸是组成生物机体蛋白质的基本成分，是构建细胞、修复组织的基础材料。 • 氨基酸分子结构中含有不对称的碳原子，属于手性分子。非天然的氨基酸多为外消旋体，D型氨基酸一般不能为生物所利用，必须在体内转化为L型才能被吸收。 • 手性氨基酸的分离分析，在蛋白质的研究、医药、食品、卫生等领域具有重要意义，是分析化学研究中的热点和难点之一。

7. 氨基酸对映体分离的方法 • 高效液相色谱法 （HPLC） 优点：灵敏、快速、分辨率高、重复性好、样品分析量大等 缺点：操作复杂费时，制备的手 性色谱柱费用昂贵。 • 高效毛细管电泳 （HPCE） 优点：分离效率高，分析速度快，操作简单，运行成本低，对环境造成的污染小，具有独特的优势，是氨基酸一种理想的分离方法 缺点：制备能力差些

9. 毛细管电泳在氨基酸对映体分离检测中的应用 • 间接拆分法（手性消除） • 直接拆分法 • 主客体络合 • 配体交换络合 • 手性胶束包合 • 蛋白质亲合

10. 配体交换法 • 是分离手性氨基酸的一种最早的方法，通常指中心离子和L型氨基酸或是缩二氨酸形成螯合物做手性选择剂，利用对映体和螯合物形成不同不对称物的稳定性和光学结构的差异而达到分离。 • 中心金属离子一般是Cu2＋, Zn2＋, Ni2＋, Mn2＋, Co2＋等，其中Cu2＋最为常用、有效。

11. 苯丙氨酸(Phe)是一种重要的氨基酸，主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分；还可作为昆虫人工饲料的成分；对治疗苹果疱茄病亦有效。苯丙氨酸(Phe)是一种重要的氨基酸，主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分；还可作为昆虫人工饲料的成分；对治疗苹果疱茄病亦有效。 L-苯丙氨酸是人和动物所需要的 一种氨基酸，而D-苯丙氨酸是生产 艾滋病病毒抑制剂的重要中间体。 3.苯丙氨酸(Phe)对映体研究进展 Fig. 1 The structure of Phenylalanine(pI = 5.48)

12. 苯丙氨酸对映体的拆分方法： 手性膜法、薄层色谱、离子色谱法、高效液相色谱和毛细管电泳等

13. 表1毛细管电泳拆分氨基酸对映体的比较

14. 目前所采用的检测方法通常以光学检测（紫外和荧光）为主，由于大部分氨基酸都缺乏光学活性，需进行柱前或柱后衍生化处理才能检测，操作费时繁琐，且易引入新的误差 。 电化学检测作为一种灵敏度高、选择性好的检测方法在毛细管电泳分离分析中已经得到广泛的应用，其中电导检测法具有通用性，氨基酸无须经过衍生即可检测，操作简单方便。 4.研究背景及意义

15. 本论文利用本课题组研制开发的CES2003型毛细管电泳仪，主要采用电导检测的方法，分离检测了未衍生化的苯丙氨酸对映体，并对分离机理进行了初步探讨。本论文利用本课题组研制开发的CES2003型毛细管电泳仪，主要采用电导检测的方法，分离检测了未衍生化的苯丙氨酸对映体，并对分离机理进行了初步探讨。 Fig.2 CES2003型毛细管电泳仪器示意图

16. 二、实验及讨论 • 2.1仪器与试剂 • CES2003毛细管电泳仪(高压电源，安培/电导检测器，毛细管数据工作站) • pHS-3C型酸度计 • 熔融石英毛细管柱（50cm×50μm I.D.） • CQ-2B型超声波清洗器 • 分析纯：氢氧化钠（NaOH），柠檬酸(C6H8O7·H2O)，乙酸铜（Cu(CH3COO)2·H2O，羟丙基甲基纤维素（HPMC） • 层析纯：L-苯丙氨酸，D,L-苯丙氨酸、L-赖氨酸 • 所用水为二次去离子重蒸水

17. 2.2 实验方法 • 连接好毛细管电泳仪和检测装置，毛细管柱在使用前用0.1 mol/L HCl溶液、去离子水、0.1 mol/L NaOH溶液、去离子水和运行缓冲液分别冲洗约5 min，检测电极用超声波清洗。 • 更换缓冲液或者每进样6次后也需按上述步骤清洗毛细管和电极。 • 实验条件：室温(25℃)、相对湿度小于75%。

18. 2.3实验结果与讨论 2.3.1 手性选择体系的选择 Fig.3 The effect of three different chiral selectors on the resolution a. Cu(II) b. Cu(II)+L-lys c. Cu(II)+L-Lys+HPMC

19. 2.3.2 铜和L-赖氨酸络合物配比和浓度对分离度的影响 Tab. 2 The effect of concentration ratio of Cu(Ⅱ) to L-Lys , concentration of Cu(Ⅱ) and L-Lys on the resolution Conditions: 1.0 mmol/L NaOH+ 0.4 mmol/L Cit+ 20 mg/L HPMC; working voltage: 15 kV; injection time: 8 s; injection voltage: 9.0 kV.

20. 2.3.3 羟丙基甲基纤维素（HPMC）浓度对分离度的影响 Fig.4 The structure of hydroxypropyl methyl cellulose

21. Fig.5 The effect of HPMC concentration Conditions: 1.0 mmol/L NaOH+ 0.4 mmol/L Cit +1.0 mmol/L Cu(Ac)2+2.0 mmol/L L-ys; working voltage: 15 kV; injection time: 8 s; injection voltage: 9.0 kV.

22. 2.3.4 缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响 对比柠檬酸(Cit)－氢氧化钠(NaOH)、乙酸钠(NaAc)－氢氧化钠(NaOH)、柠檬酸(Cit)－三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸(H3BO3)－乙酸(HAc)和乙酸铵(NH4Ac)－乙酸(HAc)这几种缓冲体系，实验发现只有在柠檬酸(Cit)－氢氧化钠(NaOH)缓冲体系中，苯丙氨酸对映体才能得到分离。 柠檬酸浓度对对映体的分离影响很大，浓度太低，对映体得不到完全分离；浓度太高，对映体也得不到分离；浓度更高，没有对映体峰出现，故实验选择 Cit 浓度为0.4 mmol/L。固定柠檬酸浓度后，加入氢氧化钠以调节运行液的pH。

23. Tab.3 The effect of NaOH concentration on the resolution Conditions: 0.4 mmol/L Cit +1.0 mmol/L Cu(Ac)2 +2.0 mmol/LL-Lys+ 20 mg/L HPMC; other conditions as Fig.5

24. 2.3.5 进样方式的选择 对比了气压进样、重力进样和电动进样三种方式对样品测定结果的影响。电动进样具有较好的精密性，且操作简单，但是进样量较大时会引起区带展宽，使分离度下降，线性范围较窄；采用压力进样的峰形较窄，重现性不好，灵敏度较低，分离度没有改善；采用重力进样，分离度下降，且会出现杂质峰。 本实验采用电动进样方式，进样电压为9.0kV，进样时间为8 s。

25. 2.3.6分离电压的选择 考察了分离电压从9 kV至20 kV对分离的影响，电压较低时，样品分离度增大，但是分离时间太长；加大分离电压，可以缩短分离时间，但同时分离电流也增加，产生的焦耳热也增大，体系运行不稳，甚至有气泡产生，严重影响实验效果，柱效和分离度下降。 本实验选择分离电压为15 kV。

26. 2.3.7线性范围、检出限和精密度 Tab.3 The linear calibration curve of Phe 相同实验条件下重复进样6次，L-苯丙氨酸的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为3.2％和4.0％

27. Fig.6 The linear calibration curve of Phe Conditions: 1.0 mmol/L NaOH+0.4 mmol/L Cit+1.0 mmol/L Cu(Ac)2+2.0 mmol/LL-Lys+20 mg/L HPMC; other conditions as Fig.5

28. Fig.7 The electropherogram of D,L-Phe Conditions: 1.0mmol/LNaOH+0.4 mmol/LCit +1.0mmol/L Cu(Ac)2 +2.0mmol/LL-Lys+ 20 mg/L HPMC; other conditions as Fig.5

29. 2.4 拆分机理初步探讨 铜离子与L-赖氨酸以1 : 2形成三元络合物： L-Lys+ Cu(Ⅱ) (L-Lys)Cu(Ⅱ) L-Lys + (L-Lys)Cu(Ⅱ) (L-Lys)2Cu 当苯丙氨酸进入缓冲系统时，D-Phe和L-Phe分别取代一分子的L-Lys，形成两种不同的三元络合物： (L-Lys)Cu(L-Lys)+ L-Phe(L-Lys) Cu(L-Phe)+ L-Lys (L-Lys)Cu(L-Lys)+ D-Phe(L-Lys) Cu(D-Phe)+ L-Lys 根据两者的稳定性和光学结构的差异，引起二者的电泳淌度不同，D,L-Phe得到分离。

30. 三 、结论 本实验本文以铜-L-赖氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二元手性选择体系，用毛细管区带电泳－电导法成功对未衍生的苯丙氨酸对映体进行分离，方法高效简便、分析成本低，可发展于实际样品的分析应用 。

31. 创新点： 1、首次采用二元手性选择体系：Cu2++L-Lys+HPMC，以Cit-NaOH为运行缓冲夜，直接拆分未衍生化的苯丙氨酸对映体； 2、采用毛细管区带电泳－电导法拆分模式，避免柱前、在柱或柱后衍生 ，降低分析成本； 3、方法高效简便、分析成本低、对环境造成的污染小。

32. 四 、致谢 衷心感谢导师谢天尧老师的悉心指导和热情关怀！ 特别感谢陈丽师姐的鼎力帮助，感谢实验室其他师姐的支持和鼓励！ 感谢03级本科同学的支持和鼓励！ 感谢中山大学本科生科研基金的资助！

33. 谢谢！Thank you!