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亲和层析 法

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亲和层析 法 - PowerPoint PPT Presentation


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亲和层析 法. 1 原理: 要有一对具有高 亲和 性的分子 2 亲和吸附剂 : 有 很多 亲和 性 吸附剂 可利用 3 金属螯合层析法 : 利用分子 与金属 的吸引力. 亲和色谱 原理:酶与载体之间的特异性作用。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上,然后用适当的底物特异地洗提。. ■ 亲 和 层 析法的四 项 要素:. 配 体 Ligand (A). (1) Solid Matrix. 耦合反 应 (3) Coupling Reaction. 洗脱 Elution (4). B. (2). B. B. Specific

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

亲和层析法

  • 1原理:要有一对具有高亲和性的分子
  • 2亲和吸附剂:有很多亲和性吸附剂可利用
  • 3金属螯合层析法:利用分子与金属的吸引力
slide2
亲和色谱原理:酶与载体之间的特异性作用。亲和洗提酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上,然后用适当的底物特异地洗提。亲和色谱原理:酶与载体之间的特异性作用。亲和洗提酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上,然后用适当的底物特异地洗提。
slide3

■ 亲和层析法的四项要素:

配 体

Ligand (A)

(1)

Solid Matrix

耦合反应(3)

Coupling Reaction

洗脱

Elution

(4)

B

(2)

B

B

Specific

Binding

Substance (B)

杂质

B

B

slide4

■ 亲和层析法的作用机理:

(1)

(2)

(3)

X

B

Washing

Elution

A

A

A

Sample

B

亲和基团

配体

X

B

固相载体

slide5

■ 典型的亲和层析操作:

Protein

Activity

pH 2.05

*

Elution volume

slide6

■ 专一性作用力的种类:

II. Interaction Forces:

(1) Hydrogen bond

(2) Hydrophobic interaction

(3) Electrostatic interaction

(4) Van der waals interaction

I. Conformational Match:

Van der waals interaction

两分子间因构象互补所造成的

吸引力是由范德华力所贡献

+

-

=O…H-N-

Kd

+

slide7

Van der Waal interactions

范德华键数目够多就足以产生亲和力

vdw

vdw

between non-polar surfaces

slide8

■ 生化分子的反应基团:

氰基

-C N

●●●●●

醛基

-HC=O

●●●

羧基

-COOH

胺基

-NH2

●●

醇基

-OH

硫醇基

-SH

-O-

烷基

-CH3

X

slide9

■ 可与各种配体基团反应的载体:

Pharmacia

配体基团

親和性载体

反应基团

反应方式

直接反应

CNBr-activated Sepharose 4B

-C≡N

加 EDC*

-COOH

-NH2

CH-Sepharose 4B 或活化型

直接反应

N-OH-succinimide

Oxirane环氧己烷

Epoxy-activated Sepharose 4B

直接反应

加 EDC*

-NH2

-COOH

AH Sepharose 4B

直接反应

-OH

oxirane

Epoxy-activated Sepharose 4B

直接反应

oxirane

Epoxy-activated Sepharose 4B

-SH

DTT 活化

-S-S-R

Thiopropyl-Sepharose 4B

直接反应

-G-S-S-R

Activated thio-Sepharose 4B

* EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl

slide10

■ 亲和性载体的反应基团:

CNBr

-OH

NH2-Protein

NH

-O-C N

-O-C N

-O-C-NH-Protein

CNBr activated

-NH-C-C-C-C-C-C-NH2

Amino

Carboxylic

-NH-C-C-C-C-C-C-COOH

O

O

-NH-C-C-C-C-C-C-C-O-N

N-Succinimide

琥珀酰亚胺

O

-O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C-C

Epoxy

O

OH

spacer arm

slide11

■ 各种亲和性载体及其专一性基团:

Pharmacia

配 体

親和性分子

说 明

免疫吸附剂,大多自行合成

对应的抗原

抗体

对应的酶

酶的专一性结合

底物或抑制剂

部分 IgG

单株抗体纯化

Protein A

糖蛋白

对a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性

Con A刀豆素

凝血蛋白等

Heparin Sepharose CL-6B

Heparin

mRNA

Oligo (dT)-cellulose

Oligo (dT)

NAD(P)+ 结合酶

Blue Sepharose CL-6B

Cibacron-Blue

NAD(P)+ 结合酶

5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B

AMP, ADP

用来纯化lectin

Lectin

单糖及衍生物

(还有更多其它亲和配体和载体)

slide12

■ 金属螯合层析法:

imidazole

固相载体

Ni

His

His

His

Protein

C-COOH

elution

-O-C-C-C-O-C-C-C-N

C-COOH

OH

OH

Metal Chelate Affinity Chromatography

Juang RH (2004) ECX

slide13

Chitin

Trypsin

CH2OH

CH2OH

O

O

O

O

OH

OH

NH

O=CH3

NH2

■ 亲和层析法实例的原始材料:

CHOM

鸡蛋粘多糖蛋白

slide14

■ 以亲和层析法纯化 Trypsin:

Disc-PAGE

SDS-PAGE

Chitin

CHOM

Trypsin

A B C&D

以凝胶电泳检验亲和层析

操作过程各步骤样品→

A B C = D

slide15

■ Hydroxyapatite 吸附剂:

羟基磷灰石

(Ca5(PO4)3OH)2

可选择NaCl或 磷酸 等不同洗脱条件

Bio-Rad CHT

slide16
疏水性层析法:利用分子间的疏水性引力
  • 液相分配:分子在两液相间的分配比例不同
slide17

■蛋白质表面的极性或非极性分布:

Hydrophobic area

Activie site

Superxoide

dismutase

(SOD)

Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig. 21-36

slide18

■ 疏水性及反相层析法原理:

C18 = -C18H37

HIC (liquid-solid)

Reverse Phase Chromatography (liquid-liquid)

Polar

solvent

Non-polar

solvent

Polar

solvent

+

+

+

+

Non-polar

area

+

+

Polar

phase

+

+

+

+

+

Non-polar

area

Hydrophobic group

Polar area

Using non-polar groups as a stationary phase

Using ion-exchanger

C6 = -C6H13

Phenyl = -C6H6

Juang RH (2004) ECX

slide19

■ Hydrophobic interaction 色析法:

Ammonium sulfate (% sat.)

25

0

BA

20

10

15

20

Ethylene glycol (%)

Protein concentration

10

30

5

40

50

100

200

300

400

Elution volume (mL)

Pharmacia HIC

slide20

选择色谱类型是最重要的也是设计知识面最广的难题。填料填料颗粒、孔径及柱尺寸大小流动相组合最佳分离纯化工艺蛋白质工业化分离纯化流程图合成(发酵,组织培养,多肽合成)提取和浓缩(匀化,离心,过滤,液-液萃取)预分离(吸附,沉淀,液—液萃取)精细分离和纯化(色谱)浓缩(超滤,排阻色谱)无菌过滤和干燥或结晶)选择色谱类型是最重要的也是设计知识面最广的难题。填料填料颗粒、孔径及柱尺寸大小流动相组合最佳分离纯化工艺蛋白质工业化分离纯化流程图合成(发酵,组织培养,多肽合成)提取和浓缩(匀化,离心,过滤,液-液萃取)预分离(吸附,沉淀,液—液萃取)精细分离和纯化(色谱)浓缩(超滤,排阻色谱)无菌过滤和干燥或结晶)