上海市临床科研基本实验技能培训 —— 哺乳动物细胞培养：基础交流

1. High technology and service Eyeing for Integrated Solution R&S, your reliable cooperator! 上海市临床科研基本实验技能培训——哺乳动物细胞培养：基础交流 Meeting date: 2009/12/18 Speechmaker: Youzhi Huang（ph D.） E-mail: service@research-bio.com 上海锐赛生物技术有限公司 Shanghai R&S Biotechnology Co., Ltd.

2. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 目录 • 细胞培养基本概念 • 细胞培养基本要求 • 细胞培养基本技术 • 锐赛细胞相关技术服务

3. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 一、细胞培养基本概念 • 细胞培养定义 • 细胞培养简史 • 生长类型 • 细胞形态 • 传代次数

4. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养定义 • 定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 • 优点： 1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4．应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）； • 缺点： • 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； • 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。

5. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养简史

6. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞类型 按生长方式: • 贴壁型细胞（Monolayer cells） • 悬浮型细胞（Suspension cells） • 绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）： • 成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells） • 上皮型细胞（Epithelium-liked cells） • 其它，不定型

7. 细胞形态 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 多形细胞型 难以确定规律和稳定的形态 如神经组织的细胞等 成纤维型细胞 梭形或不规则三角形 中央有卵圆形核 胞质向外伸出长短不同的突起 中胚层间质起源 上皮型细胞 扁平不规则多角形 细胞中央有圆形核 紧密相连单层膜样生长 内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞 散在生长，一般不连成片 细胞质经常伸出伪足或突起 活跃的游走或变形运动 羊水细胞培养的早期

8. 接触抑制（Contact inhibition） 细胞相互接触时，将停止增长； 细胞停留在细胞周期的G0期； 转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator!

9. 细胞传代次数（Passage Number） High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! • 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 • 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 • 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。

10. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 原代培养与细胞系 克隆 （clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 原代培养  （primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 细胞株 （cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 细胞系 （cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖

11. 细胞系资源 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! • The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA

12. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 二、细胞培养基本要求 • 常用仪器设备 • 培养器皿 • 培养基 • 血清 • 其他细胞培养试剂

13. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 常用仪器设备 • 超净台或生物安全柜：细胞操作 • CO2培养箱：细胞培养 • 液氮罐：细胞长期冻存 • 37℃ 水浴：培养溶液预热，细胞复苏 • 倒置显微镜：观察细胞 • 离心机：收集细胞，细胞常用300g转速5min • 冰箱：细胞培养溶液分装储存 • 负压吸引器：细胞培养废液吸取

14. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 超净台或生物安全柜 水平风超净台 生物安全柜 垂直风超净台

15. 培养器皿 Culture flask Culture Plate High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator!

16. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养基 • 干粉培养基和液体培养基 • 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 • 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 • 常用的培养基种类 • RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F12等

17. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 培养基的选择 没有一定的标准，有几点建议可供参考： • 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 • 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 • 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

18. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 血清使用注意事项 • 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 • 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 • 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。 • 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质

19. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 血清沉淀物 • 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。 • 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。

20. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 谷氨酰胺 • 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加 • 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 • 使用终浓度为1-4mM • 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L） • 配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM

21. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 酚红 • 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 • 红色表示中性pH • 黄色代表酸性pH • 紫色表示碱性pH • 在一些特殊培养液中不含酚红 • 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用

22. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞消化液 • 分离组织和分散细胞 • 常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用 • 胰蛋白酶溶液 • 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 • 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用 • EDTA·4Na 溶液 • 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 • 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长

23. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 三、细胞培养基本技术 • 细胞原代培养 • 细胞换液与传代 • 细胞冻存与复苏 • 细胞计数与活力 • 细胞污染与控制

24. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 鼠胎组织细胞原代培养 • 取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 • 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 • 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养

25. 细胞换液 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 换液： • 全量换液和半量换液 换液时机的选择： • 培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 • 细胞状态

26. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞传代 • 原代细胞传代以便获得稳定的细胞株 • 细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续 • 接触抑制 • 营养枯竭 • 将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养 • 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增3～6次

27. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞冻存 冷冻保存要点 • 冷冻过程要缓慢： • 4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存 • 或使用程序降温盒，每秒下降1 ℃ • 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 • 细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。 常用细胞冷冻保存液 • 5%或10％DMSO＋完全培养液 • 10％甘油＋完全培养液

28. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞复苏 • 快速解冻 • 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟） • 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO • 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 • 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中

29. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞计数及活力

30. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞污染 • 细菌污染 • 真菌污染 • 细菌和真菌的清除 • 支原体污染 • 支原体的清除

31. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细菌污染 • 细胞培养常见的污染 • 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 • 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 • 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

32. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 真菌污染 • 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

33. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细菌和真菌的清除 使用抗生素 • 抗生素对杀灭细菌较有效。 • 联合用药比单独用药效果好。 • 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 • 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。

34. 支原体污染 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 95％以上是以下四种支原体： • 口腔支原体（M.orale） • 精氨酸支原体（M.arginini） • 猪鼻支原体（M.hyorhinis） • 牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii） 危害： 世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： • 操作环境不良 • 操作人员的疏失 • 实验器具不洁等 • 已受污染的细胞 • 已受污染的培养基、血清

35. 支原体污染检测 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 荧光染色法 电镜检查：扫描电镜、透射电镜 支原体培养 聚合酶链反应(PCR)法

36. 支原体污染表现 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体

37. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 支原体的清除 • 支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法 • 每4天换一次液，连续处理15天 • 清洗纯化法 • 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 • 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. • 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。   • 药物辅助高温处理法 • 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 • 支原体特异性血清法 • 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

38. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 四、锐赛细胞相关技术服务 • 上海锐赛生物公司简介 • 锐赛细胞相关技术服务

39. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 上海锐赛生物简介 • 上海锐赛专注于向国内生命科学研究、医学临床科研应用及生物医学产业研发提供最新技术咨询、全方位现代实验技术服务。 • 锐赛公司前身是一个生命科学研究交流团队，团队组建于2003年，是非盈利的学术交流平台，技术团队建有基因操作、基因组分析、细胞、病毒包装、RNAi等多个成熟的实验平台，团队人员操作经验丰富，硕士学历以上占85%。 • 公司愿景：立足于深厚的分子、细胞生物学背景和扎实的科研实验技术服务基础，立命于终身为祖国的科研工作者提供一流的研究产品和全方位实验技术服务，并孜孜不倦地打造出我们自己研发生产的、比国际一流品牌产品还过硬的科研产品民族品牌！

40. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 锐赛细胞相关技术服务 细胞转染 • 瞬时转染 • 稳定转染细胞株的构建 流式细胞检测 • 细胞周期 • 细胞凋亡 • 细胞表面抗原（CD系列） 肿瘤细胞生物学检测 • 细胞活力测定 • 肿瘤细胞基质黏附实验 • 肿瘤细胞侵袭实验 病毒包装 • 腺病毒包装 • 慢病毒包装 • 逆转录病毒包装 RNA干扰 • siRNA干扰评价 • 慢病毒RNAi干扰 • 腺病毒RNAi干扰

41. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞转染 瞬时转染 特点： • 技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（FuGene）、电穿孔仪等 • 根据客户的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化 应用： • 观察目的基因表达蛋白在细胞中的功能（短期效应） 稳定转染细胞株构建 特点： • 技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（ FuGene）、电穿孔仪、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等 • 根据客户选择的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化 • 可选用高效的病毒转导方法建立稳定表达的细胞株 • 应用抗生素筛选出稳定表达细胞株 应用： • 观察目的基因表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期研究）

42. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 流式细胞检测 特点： • 技术平台：FACSCalibur7500 • 单细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析 • 特定细胞群体的分选 • 精度和灵敏度高，重复性好 应用： • 细胞周期 • 细胞凋亡 • 细胞表面抗原：CD 系列

43. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 肿瘤细胞生物学检测 细胞活性测定 特点： • 技术平台： CCK-8法 • CCK-8法具有操作快速、准确度高、灵敏度高、经济实用和对细胞无毒性等优点。 应用： • 生物活性因子的活性检测、大规模药物筛选、细胞增殖、细胞毒性、药敏实验等。 肿瘤细胞基质黏附实验 特点： • 技术平台：Transwell法结合CCK-8法 应用： • 检测肿瘤细胞的基质黏附能力 肿瘤细胞侵袭实验 特点： • 技术平台：Transwell法 应用： • 检测肿瘤细胞的侵袭能力

44. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 病毒包装系统 腺病毒系统 • 为复制缺陷型，生物安全性高 • 感染宿主细胞范围广，可应用于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞转导效率高 • 不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性 • 可有效进行增殖，病毒滴度高 慢病毒系统 • 为第4代自身灭活复制缺陷型，生物安全性高 • 可整合到受感染细胞的基因组，从而长期稳定表达外源目的蛋白 • 感染宿主细胞范围广，可应用于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，转导效率高 逆转录病毒系统 • 可以整合从而长期稳定表达 • 感染宿主细胞范围较广，可应用于难转染的细胞，如原代细胞，转导效率高 • 免疫原性低

45. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! RNA干扰 特点： • 为靶基因设计，构建一组miRNA干扰载体 • 采用Pol II 强启动子CMV，表达水平更高，干扰效果更强 • 可表达出与目的基因100%同源的人工化的miRNAs，对靶基因进行切割；>70%的knockdown效率 • 绿色荧光蛋白（GFP）和感兴趣的miRNA可协同表达，方便追踪miRNA的表达 • 针对客户靶细胞系，进行转染条件优化，确保转染效率 • 对难于转染的细胞系，可选用腺病毒或慢病毒转导的方法，确保干扰效果 • 针对某靶基因的4条miRNA序列，在转染效率>80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown • 可制备稳定沉默特定基因的细胞株

46. High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 谢 谢！ Good luck ! Thank You !