RNAi-Mediated Targeting of Heterochromatin by the RITS Complex

1. RNAi-Mediated Targeting ofHeterochromatin by the RITSComplex Andre´ Verdel, Songtao Jia, Scott Gerber, Tomoyasu Sugiyama, Steven Gygi, Shiv I. S. Grewal, Danesh Moazed Níels Árni Árnason Sævar Ingþórsson

2. Schizosaccharomyces pombe • Schizosaccharomyces pombe (fission yeast) • Oftast einlitna, sem auðveldar að sjá hvort stökkbreyting hefur orðið eða ekki.

3. Myndun þéttlittnis • S.pombe inniheldur langa strengi þéttlitnis á litningsendum, við þráðhaft og á silent mating type svæðum. • Myndun þéttlitnis á þessum stöðum krefst breytinga á litninu sem kallar síðan á tvö histónbindandi prótein, Swi6 sem er homólog við manna og bananaflugu HP1 próteinið, og Chp1

4. RNAi • Þegar slökkt er á genum með RNAi leiðinni er notast við tvíþátta RNA (dsRNA) • Dicer ensím klippir tvíþátta RNAið niður í stuttar raðir (um 22 núkleótíð). • (siRNAs) hlaða sér síðan á prótein flóka sem kallast RISC (RNA induced silancing complex) • Flókinn inniheldur prótein úr Argonaute/PIWI fjölskyldunni sem sigtar út samsvarandi/samstofna mRNA og óvirkjar þau.

5. RNAi • Þættir sem taka þátt í RNAi leiðinni í öðrum lífverum eru einnig nauðsynlegir í S.pombe, • Úrfelling (deletion) á einhverjum þessara þátta eins og Dicer(dcr1+), Argonaute (ago1+) og RNA háðum RNA pólýmerasa (rdp1+) truflar myndun þéttlitnis.

6. Stuðningur við kenningar um að RNAi taki þátt í myndun þéttlittnis. • Báðir DNA þættir þráðhafts endurtekninga í S.pombe eru umritaðir og hefur fundist siRNA sem passar við þráðhafts endurtekningarnar. • Nýlegar tilraunir hafa gefið í skyn að tilbúin (gerð af manna höndum) dsRNA gerð úr hárlykkju cunstruct geti slökkt á hómólóg röðum með því að mynda þéttlitni þar sem RNAi er nauðsynlegt.

7. Í þessar rannsókn er leytast við að svara þeirri lykil spurningu hvernig lítil RNA mynduð út frá RNAi leiðinni koma af stað myndun þéttlitnis í fission yeast (klofnings gersveppum).

8. Til að bera kennsl á þá þætti sem eru mikilvægir í RNAi stýrðum tengslum við þéttlitnisflóka, var gengið út frá því að þessir þættir myndu virka snemma í myndun þéttlitnis • Væru nauðsynlegir við þéttlitninssérhæfðar histón breytingar. • Chp1 er binst þráðhafts endurtekningum og er nauðsynlegt fyrir methylleringu H3-K9(methyllering á lysin 9) og sem kallar síðan á Swi6.

9. Til að kanna hvort Chp1 tæki þátt í tengslunum milli RNAi og myndun þéttlitnins var notast við TAP (tandem affinity purification procidure) Gerðir voru stofnar sem framleiddu TAP merkt Chp1 til að bera kennsl á þá þætti sem eiga samskipti við Chp1. Mynd 1

12. Nokkrar prótein tegundir af stærðunum 65, 90, 100 og 120 kD voru sérstaklega hreinsuð úr Chp1-TAP stofnum • Mass spectrometry á böndum teknum úr gelinu ásamt prótein mixture báru kennsl á 120 og 100 kD böndin sem Chp1, 90 kD sem Ago1 og 65 kD bandið var áður óskilgreint prótein SPBC83.03c sem hópurinn skírði Tas 3 (targeting complex subunit 3) • Stærðinn á Chp1 böndunum var breytileg milli tilrauna sem gefur til kynna að 100 kD bandið sé niðbrots afurð Chp1

13. http://www.asms.org/whatisms/p4.html

14. Til að komast að því hvort Chp1, Ago1 og Tas3 séu saman í próteinflóka var hannaður S.pombe stofn sem framleiddi fullvirk Tas3-TAP prótein. • Affinity purification og mass spectrometry squencing var sýnt fram á að Chp1 og Ago1 tengdust Tas3 Mynd 2 • Hreinsunartilraunir með Chp-TAP og Tas-TAP sýndu fram á að Chp1, Ago1 og Tas3 séu saman í próteinflóka sem hópurinn kallaði RITS.

16. Sýnt hefur verið fram á að Chp1 og Ago1 ásamt annara þátta RNAi leiðarinnar taka þátt í myndun þéttlitnis og þögglun á reporter genum sem sett hafa verið sett inn á þéttlittnis svæðum. • Í stofni þar sem tas3 hafði verið slegið út en innihélt ura4+ reporter gen á innermost og outermost þráðhaftsendurtekningasvæðum á litningi 1 var sýnt fram á að þögglun virkaði ekki á þessum reporter genum. Mynd 2 D á svipaðan hátt og þegar slökkt var á sir2,chp1 og ago1 genum.

17. Enn frekar sýndi litnis immunoprecipitation fram á að Tas3 er nauðsynlegt fyrir methylleringu á H3-k9 og • Swi6 staðsetningu á ura4+ geninu sem sett var inn á fyrrgreindum stöðum. Mynd 2 E.

18. litnis immunoprecipitation • Próteinið látið bindast við DNA með formaldehyde. • Litni einangrað • Mótefni, sértæk fyrir próteinið. • Prótein hreinsað af • PCR og greining á DNA • Mynd. www.biolynx.ca/promotions/chipit.html

19. Tengsl RITS og RNA • Til að kanna tengsl RITS complexins við sRNA var RNA einangrað úr hreinsuðum Control og Chp1-TAP afurðum Þetta RNA var síðan merkt með [5’-32P]pCp. RNA lígasi úr T4 veiru var notaður. • Merktu RNA raðirnar voru síðan rafdregnar á 15%urea polyakrílamíð geli

20. Tengsl RITS og sRNA

21. Tengsl RITS og sRNA • Þegar búið var að sýna fram á að litlar RNA sameindir væru til staðar í RITS komplexinum var næsta skref að finna út hvernig þessar RNA sameindir voru útbúnar. • Ræktaður var stofn með úrfellingu í dcr1+og athugað hvort einhver breyting yrði á magni sRNA í hreinsuðum sýnum

22. Tengsl RITS og sRNA

23. Tengsl RITS og siRNA • Nú var búið að sýna fram á að það er Dicer RNAasinn sem er nauðsynlegur fyrir myndun þessara stuttu RNA búta. • Næsta skref var þá að finna hvaðan þessir RNA bútar voru upprunnir • Sýnt hafði verið fram á að RNA bútar í S pombe samsvara endurteknum röðum í þéttlitni nálægt þráðhaftinu

24. Tengsl RITS og siRNA • Til að kanna hvort að þeir siRNA bútar sem einangraðir voru úr sýnunum væru upprunnir frá þessum svæðum voru notaðir tilbúnir þreifarar sem höfðu verið hannaðir til að þáttaparast við RNA úr S. pombe í annarri rannsókn.

25. Tengsl RITS og siRNA

26. Tengsl RITS og siRNA • Til að tryggja að þessar niðurstöður væru réttar var framkvæmt annað próf þar sem einangrað siRNA var merkt með 32P og látið þáttaparast við DNA búta sem ættaðir voru af þéttlitnissvæðum nálægt þráðhaftinu

27. Tengsl RITS og siRNA

28. Mikilvægi siRNA fyrir staðsetningu RITS komplexins • Vitað er að chp1 binst endurtekningum á þráðhaftssvæðum og er nauðsynlegt fyrir methyleringu á H3-K9 og tengingu á swi6. • Kannað var hvernig binding RITS komplexins við DNA breyttist þegar siRNA ferlið (RNA dependant pol., dicer, argonaute) er truflað/eyðilagt

29. Mikilvægi siRNA fyrir staðsetningu RITS komplexins

30. Mikilvægi siRNA fyrir staðsetningu RITS komplexins

31. Mikilvægi siRNA fyrir staðsetningu RITS komplexins

32. Niðurstaðan