1 / 42

双价抗虫植物表达载体转化紫花苜蓿 “ 中苜一号 ” 的实验进展 学生：熊恒硕 导师：金银根

双价抗虫植物表达载体转化紫花苜蓿 “ 中苜一号 ” 的实验进展 学生：熊恒硕 导师：金银根. 1 前言 苜蓿既是重要的饲料作物 , 同时又是改良土壤、保持水土的重要植物。随着我国西部大开发实施退耕还林还草、改善生态环境的推进，苜蓿产业发展势头十分迅猛。

feleti
Download Presentation

双价抗虫植物表达载体转化紫花苜蓿 “ 中苜一号 ” 的实验进展 学生：熊恒硕 导师：金银根

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 双价抗虫植物表达载体转化紫花苜蓿“中苜一号”的实验进展双价抗虫植物表达载体转化紫花苜蓿“中苜一号”的实验进展 学生：熊恒硕 导师：金银根

  2. 1 前言 苜蓿既是重要的饲料作物,同时又是改良土壤、保持水土的重要植物。随着我国西部大开发实施退耕还林还草、改善生态环境的推进，苜蓿产业发展势头十分迅猛。 随着种植面积剧增和大面积种植，也为苜蓿虫害的发生和流行创造了有利的生态条件，近两年来虫害问题日益突出，已成为制约苜蓿产业化发展的主要因素之一。在我国苜蓿生产的几个重要省区，如：内蒙古、宁夏等地，蚜虫类包括豌豆无网长管蚜、苜蓿无网长管蚜和苜蓿斑蚜，及蓟马类包括苜蓿蓟马、牛角花翅蓟马、普通蓟马、大蓟马等都已普遍发生，特别是苜蓿蓟马是近年来传入我国的重要外来有害生物之一，在北京等地危害猖獗，导致重大的经济损失。 此外，刺吸危害的其它害虫如飞虱类、盲蝽类等，还有潜叶蝇和地老虎，都给我国苜蓿生产带来了不同程度的损失。

  3. 斑翅苜蓿蚜 端大蓟马 赤角盲蝽

  4. 豌豆潜叶蝇 飞虱 地老虎

  5. 2 国内外转基因苜蓿研究进展 随着生物技术的发展和广泛应用,利用转基因技术改良苜蓿的性状已成为可行的手段。另外苜蓿具有产量高、品质好、各类家畜喜食等优点,利用苜蓿作为转基因受体来研究草食牲畜的植物食用疫苗也是是一项非常有意义的工作。因此,转基因技术在苜蓿育种工作中具有广阔的应用前景。

  6. 2.1 抗逆性 2.1.1 耐寒、耐旱基因的转化 诸如干旱、寒冻、洪水等环境压力对苜蓿带来的伤害都会造成氧自由基的增加。一类叫超氧化物歧化酶(SODs)的金属蛋白有清除氧自由基，将其转变为过氧化氢和氧分子的功能。1993年Mckersie等将蓝雪状烟草的Mn—SOD基因利用农杆菌转入苜蓿，田间试验证明，转基因植株的抗寒抗旱性都明显增强。韩利芳 等(2004)通过根癌农杆菌介导法将烟草Mn—SOD基因的cDNA序列导入保定苜蓿，成功地诱导了转基因植株再生，后经Mn—SOD活性检测表明，部分转基因植株的SOD活性显著高于对照植株。

  7. 2.1.2 耐盐 土壤盐碱化是影响农业和畜牧业生产的严重问题，全世界的盐碱地约占陆地面积的1/3，我国也有大面积的盐碱地，且有逐年上升的趋势。而地球上的淡水资源仅占地球表面积水资源的1.6%，在人口不断增加，耕地日趋减少和淡水资源不足的严重压力下，如何利用好大面积的盐碱地是我们所迫切需要解决的问题。采用传统的育种方法，选育耐盐品种进展极为缓慢。随着分子生物学的发展，人们现在可以依赖基因工程技术提高牧草的耐盐碱性。 目前苜蓿的耐盐基因已被确认。公认的转录因子(Alfin1)在苜蓿根部可增加耐盐MsPRP2基因的表达(Wincov and Bastola，1999)。充分表达Alfinl的转基因苜蓿表现出生长加快和耐盐性提高(Winicov，2000)。另外，2003年苏金等报道Alfinl的超量表达能增强转基因苜蓿的氯化钠抗性，Alfinl cDNA编码锌指结构蛋白。2004年李小红等首次报道了基因Rtsc的功能与苜蓿中华根瘤菌的耐盐性是相关的。

  8. 2.1.3 耐铝 铝毒害最容易识别的症状就是根生长的抑制。由于根尖(根冠、分生组织和伸长区)比成熟的根部组织积累更多的铝，因而被认为是铝毒害的最初作用部位. 苜蓿对铝(Al)的毒性敏感，可导致根部发育受阻和低产。带柠檬酸合成酶基因的转基因苜蓿，因为柠檬酸含量高，故比未转基因的苜蓿表现出更长、生长更佳的根部特性(Rosellini等，2002)。带苹果酸脱氢酶基因的转基因苜蓿，因为柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和醋酸含量的增加，耐铝性也有相应增加(Tesfaye等，2001)。西南农业大学刘洋等做了棉花铝诱导蛋白基因GhAlin对紫花苜蓿遗传转化的初步研究。

  9. 2.2抗虫 1996年Sneh等将Bt基因转入苜蓿，转基因苜蓿对海灰翅叶蛾和甜菜叶蛾均有较高的抗性。(McCaslin，2002)等转Bt基因苜蓿，实验表明可以控制苜蓿象鼻虫和三叶草根象鼻虫。(Thomas等，1994)发现表达来自烟天蛾的抗弹性蛋白酶抑制剂的转基因苜蓿能减少蓟马的采食危害。Javie等人将番茄PI基因转入苜蓿后发现，转基因苜蓿对鳞翅目昆虫有较好的抗性。 国内（卢广等，2004）也做了转抗蚜GNA基因苜蓿的初步研究（农杆菌浸泡种子）。

  10. 2.3 抗除草剂 5一烯醇式丙酮酸莽草酸一3一磷酸合成酶(简称EPSP合成酶)是真菌、细菌、藻类、高等植物等体内芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的合成酶。把这种合成酶转移进苜蓿就可以起到抗草甘膦效果(Padgette等，1995)。另外1990年D Halluin将广谱性除草剂Basta和Heibac的抗性Bar基因导人苜蓿，田间试验证实转基因植株对除草剂Basta具有抗性。国内刘艳芝等（2004）通过农杆菌介导法同样获得了转Bar基因的苜蓿。

  11. 2.4 品质改良 低含量的含硫氨基酸是羊毛生长的主要限制因素。为了改进羊毛生产，富含含硫氨基酸的蛋白编码基因已被转移进入苜蓿(Higgins等，1989)。吕德扬等用高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因转化苜蓿并获得转基因植株, Suman Bagga等(2004)通过根癌农杆菌介导法成功地将控制玉米蛋白表达的CaMV35S-flPf 和CaMV35S-tLzein基因分别导入苜蓿，从而使苜蓿蛋白中含硫氨基酸的含量得到明显提高。Tal Avraham等（2005）成功获得了转Arabidopsis cystathionine γ-synthase (AtCGS)的苜蓿，提高了转化苜蓿中的甲硫氨酸和半胱氨酸的表达水平。

  12. 2.5 其它 作为生物反应器，Santos等将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1蛋白的编码基因整合到苜蓿基因组中并使其在苜蓿体内表达，牲畜采食了苜蓿植株后，体内产生抗体，从而取得对口蹄疫的免疫能力。

  13. 3 本实验选题意义 在苜蓿转基因方面，国内正式的报道较少，多集中在品质改良与耐盐、耐铝上（如前所述），抗虫转基因苜蓿仅中国农大的卢广等做了利用LBA4404/PLG66M（构建有GNA）菌株培养液直接浸泡萌动的苜蓿种子的初步探索 。 本实验采用的是构建有双价抗虫基因的质粒载体p3300-bt-pta（唐克轩，2004）转化耐盐紫花苜蓿品种“中苜一号” 。

  14. 4 实验材料 4.1含有质粒载体p3300-bt-pta的根癌农杆菌菌株EHA105。 此载体及菌株是由复旦大学遗传所唐克轩教授惠赠。本载体上连接有目的基因：苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis，Bt）类基因 CryIA(a) 和 CryIA(c) ,植物凝集素类半夏凝集素基因（Pinellia tenataagglutinin,PTA） ；筛选基因是除草剂草丁膦抗性的Bar基因。 CryIA(a)和CryIA(c) 此两类基因高抗鳞翅目类昆虫，苜蓿地中常见的鳞翅目害虫有夜蛾、棉铃虫、金龟子和象鼻虫等。

  15. 天南星科半夏属植物三叶半夏（Pinellia Ternata）为我国特有的多年生草本药用植物，半夏凝集素（Pinellia Ternata Agglutinin PTA）的粗提液对刺吸式口器的同翅目昆虫如棉蚜、桃蚜等有显著的致死作用。凝胶过滤法测定的PTA 分子量为44KDa ，由四个约12KDa的亚基组成，每个亚基具有三个甘露糖结合位点，与雪花莲凝集素（Galanthus Nivalis Agglutinin , GNA）的功能相似，具有凝血活性和抗同翅目昆虫活性。 苜蓿地中的刺吸式同翅目害虫 主要有蚜虫、蓟马、盲蝽、叶蝉等。 三叶半夏

  16. 载体构建流程图

  17. 4.2 耐盐紫花苜蓿品种 “中苜一号” “中苜一号” 苜蓿是由实验室育成的，它是以保定苜蓿、南皮苜蓿、RS苜蓿、秘鲁苜蓿为亲本材料，从1988年到1994年，在河北省中捷友谊农场及山东德州市苗圃含盐量为0.3% -0.5% 的盐碱地上，通过四代混合选择而得到的。特点为适应性强，耐盐，产量较亲本提高超过10%。

  18. 5 实验进展 5.1质粒载体p3300-bt-pta上目的基因 bt 及 pta 的PCR鉴定及保存

  19. 5.2高效转基因组织培养体系的建立 实验过程 质粒载体p3300-bt-pta 转化 感受态农杆菌 EHA105 侵染 外植体 诱导、分化、生根 筛选及农杆 菌的抑制 共培养 转基因植株 分子检测 要选择材料的适合部位作为转化受体、基本培养基、适合的抗生素浓度、侵染时的菌液浓度、侵染时间及共培养时间。

  20. 根癌农杆菌介导的转化

  21. (1)无菌苗的培养 选取大而饱满的浅黄色“中苜一号”种子，在流水下冲洗0.5h后，先70％乙醇振荡灭菌3min，然后用0.1％HgCl2振荡灭菌5min，再用灭菌ddH2O冲洗3－5次，浸种2－3h，灭菌滤纸吸水后，接种到1/2MS培养基上，光周期为16h ，长苗。

  22. 5－7天后子叶充分展开

  23. (2)适合的转化受体及诱导愈伤基本培养基的 筛选 分别选取5－7天的无菌苗下胚轴及子叶作为转化受体，分别接种到以下诱导愈伤培养基上，30d后统计愈伤诱导率，60d后统计胚状体的诱导率。 A: MS+2.4-D 2mg/l + KT 0.25mg/l B: UM+2.4-D 2mg/l + KT 0.25mg/l C: B5h+2.4-D 1mg/l + KT 0.2mg/l D: SH+2.4-D 1mg/l + KT 0.2mg/l

  24. 培养十天 下胚轴 子叶

  25. 下胚轴的愈伤诱导率及胚状体诱导率

  26. 子叶的愈伤诱导率及胚状体诱导率 因此选择子叶为外植体， UM+2.4-D 2mg/l + KT 0.25mg/l为诱导愈伤基本培养基。

  27. (3)外植体对除草剂（草丁膦）的敏感性 在进行转化实验之前，对受体材料进行抗生素敏感性测试是十分必要的。此载体的筛选基因是对草丁膦有抗性的Bar基因，草丁膦的有效成分为(Phosphinothricin ，ppt)。 选取5－7天的无菌苗子叶接种到分别含ppt 0、2、4、8、12、16（mg/l）的UM培养基上，30d后观察长势，当ppt浓度在2、4 mg/l时，对愈伤组织的影响较小，当ppt浓度在8mg/l时，基本抑制愈伤组织的生长，当ppt浓度在12、16（mg/l）时虽然可完全抑制愈伤组织增殖分化，但不利于转化组织生长。因而本实验采用8mg/L的ppt作为筛选压。

  28. 培养30天左右后

  29. (4)Carb（羧卞青霉素）最佳抗菌浓度的选择 分别选择carb浓度为100、200、300、400（mg/l），观察发现，浓度在100－200（mg/l）的培养基中有较多农杆菌未抑制住，300（mg/l）的仍有个别农杆菌长出，400（mg/l）的能很好抑制农杆菌的生长。因此选择Carb（羧卞青霉素）最佳抗菌浓度为400（mg/l）。

  30. (5)菌液OD600值的最佳选择 分别采用不同浓度的农杆菌侵染子叶，OD600 分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，观察愈伤长势情况发现，OD600 在0.2－0.8之间均有较好效果，OD600在0.6最佳，超过0.8农杆菌将无法抑制，因此选择OD600在0.6左右时的农杆菌菌液。

  31. (6)侵染时间的选择 使用同一农杆菌菌液（OD6000.6左右）分别侵染子叶5、10、20、30min，观察愈伤长势情况发现，5－10min愈伤长势良好，10min最佳，20－30min农杆菌则会过度生长而无法抑制。因此选择最佳侵染时间为10min左右。

  32. 侵染10分钟 侵染 5分钟 培养十天左右后 侵染20分钟 侵染30分钟

  33. (7)共培养时间的选择 用不同共培养时间处理，研究共培养时间对转化的影响，共培养时间分别设2、3、4、5d处理，观察发现，2－3d愈伤正常生长，3d长势最好，4－5d农杆菌则会出现抑制不住现象，愈伤长势较2－3d差，因此选择最佳共培养时间为3d。

  34. 共培养2－3天 培养10－15天后 共培养5天 共培养4天

  35. 综上所述，因此本实验选择5－7天的无菌苗的子叶作为转化受体， UM+2.4-D 2mg/l + KT 0.25mg/l为诱导愈伤基本培养基，选择OD600在0.6左右的菌液，侵染子叶10分钟，转到加盖一层无菌滤纸的共培养基上共培养3天后，转到加有ppt8mg/l和carb400mg/l的筛选培养基上，诱导愈伤的形成。

  36. 一周之后 20天左右

  37. 培养50天左右

  38. 愈伤的诱导分化长苗正在进行当中(效果不好，正在观察找原因改进)愈伤的诱导分化长苗正在进行当中(效果不好，正在观察找原因改进) 采取如下多种处理： 1、UM0 2、UM+2,4-D 2(mg/l), KT 0.25(mg/l) 3、UM+2,4-D 1(mg/l), KT 0. 5(mg/l) 4、UM+KT 0.5(mg/l) 5、UM+KT 1(mg/l) 6、UM+6-BA 2 (mg/l), NAA 0.5(mg/l) 7、MS+NAA 0.05(mg/l), 2.4-D 0.3(mg/l), +CH 250(mg/l) 8、MS+NAA 0.05(mg/l), 6-BA 0.5(mg/l) 9、1/2MS+NAA 0.5(mg/l) 10、1/2MS+NAA 0.1(mg/l), KT 0.5(mg/l) 11、1/2MS+NAA 0.1(mg/l), KT 1(mg/l)

  39. 12、1/2MS+NAA 0.5(mg/l), KT 0.5(mg/l) 13、1/2MS+NAA 0.5(mg/l), KT 1(mg/l) 14、BOI2Y 15、BOI2Y+IAA 5(mg/l) 16、BOI2Y+IAA 5(mg/l)+KT 0.5(mg/l) 17、SH 18、SH大量，MS微量，UM维生素+KT 0.4 (mg/l) 19、SH大量，MS微量，UM维生素+KT 2 (mg/l) 20、SH+NAA 0.5(mg/l), KT 1(mg/l) 21、SH+KT 0.5(mg/l) 22、SH+KT 1(mg/l) 23、SH+KT 2(mg/l) 24、SH+2,4-D 11(mg/l) , KT 1(mg/l) 发现UMO上可以分化长苗，但效率很低，生长很慢。

  40. 6 后期实验安排 1）进一步寻找到最佳诱导分化长苗培养基 2）诱导深根、成苗 3）PCR、RT-PCR分子检测 4）SOUTHERN BLOT 杂交检测

  41. 谢谢大家！ 敬请批评指导！

More Related