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基础分子生物学实验. 主讲：赵 云 王茂林 助教：周云涛（博士生）李华鹏（博士生）高勇（硕士生） 实验技术人员：杨卫 2006.3. 油菜 TOC33 基因片的克隆. 实验项目背景 国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号： 30170500 ）。 实验目的 通过本综合实验，掌握植物基因组 DNA 的制备技术、 PCR 技术、限制性内切酶酶切技术、重组 DNA 技术、克隆鉴定技术、质粒 DNA 的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。. 具体实验步骤.
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基础分子生物学实验 主讲：赵 云 王茂林 助教：周云涛（博士生）李华鹏（博士生）高勇（硕士生） 实验技术人员：杨卫 2006.3
油菜TOC33基因片的克隆 • 实验项目背景 国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号：30170500）。 • 实验目的 通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。
具体实验步骤 • Ⅰ.植物基因组DNA的制备 • Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 • Ⅲ. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化 • IV. DNA片段的体外重组与转化 • V. 克隆的筛选与鉴定 • VI.序列分析
具体实验步骤 • Ⅰ.植物基因组DNA的制备 • 取0.2g样品嫩叶至1.5mL EP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎，加入0.6mL 抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。 • 12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。 • 沉淀用50ul TE-RNase（5.0mM Tris.HCl pH 8.0，1.0mM EDTA pH 8.0，RNase A 30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。 • 加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20℃下沉淀10min ，4,000rpm离心3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ul ddH2O溶解备用。
具体实验步骤 • Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 • 引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物: 上游引物P1: 5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'， 下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。 • 在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系： 10×PCR Buffer 2.5 ul Mg2+ 1.5 ul dNTP 1.0 ul Primer 1 1.0 ul Primer 2 1.0 ul Taq 酶 0.5 ul 模板 1.0 ul ddH2O 16.5 ul
具体实验步骤 • Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 • 注意：当需要配大于三管以上的PCR体系时，在实际操作做要多配几管以减少误差。计算出各个成分需要的量，除了模板和引物不一样外，其它都可以配成总体系，振荡，混匀，低速短暂离心，然后分装，每一个管再分别加入相对应的引物和模板，振荡混匀，短暂离心。 • 然后将其放于Eppendorf PCR仪上，按以下程序进行扩增。 1)94 oC 预变性 5 min 2)94 oC变性 30 sec 3)55 oC退火 30 sec 4)72 oC延伸 45 sec 5)重复步骤2)-4)30次 6)72 oC延伸10 min
具体实验步骤 • Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 • 为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物: • 上游引物P1: 5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'， • 下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。 • 1.在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系： • 10×PCR Buffer 2.5 ul • Mg2+ 1.5 ul • dNTP 1 ul • Primer 1 1 ul • Primer 2 1 ul • Taq 酶 0.5 ul • 模板 1 ul • ddH2O 16.5 ul • 2.当需要配大于三管以上的PCR体系时，在实际操作做要多配几管以减少误差。计算出各个成分需要的量，除了模板和引物不一样外，其它都可以配成总体系，然后分装。 • 3.配成总体系在振荡器上剧烈振荡，混匀。然后用低速离心机短暂离心，对总体系进行分装，每一个管再分别加入相对应的引物和模板，振荡混匀，短暂离心。 • 4.然后将其放于Eppendorf PCR仪上，按以下程序进行扩增。 • 1)94 oC 预变性 5 min • 2)94 oC变性 30 sec • 3)55 oC退火 30 sec • 4)72 oC延伸 45 sec • 5)重复步骤2)-4)30次 • 6)72 oC延伸10 min
具体实验步骤 • Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 • 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1)称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml 50×TAE缓冲液，49ml 高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。 2)取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。 3)将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。 4)待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。 5)用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。 6)接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳； 7)当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。 8)将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。
具体实验步骤 • Ⅲ. 琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化 • 电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟； • 倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r/min离心1分钟； • 倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟； • 倒掉上清，重复步骤三； • 倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟； • 把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。
具体实验步骤 • IV. DNA片段的体外重组与转化 • 加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。 • 将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。 酶切体系： 40.0ul ddH2O 9.0ul 10×Buffer 4.0ul DNA 25.0ul Xba I、1.0ul Hind III 1.0ul
具体实验步骤 • IV. DNA片段的体外重组与转化 • 连接反应： 连接体系： （20.0ul） 酶切产物 3.0ul Buffer 1.0ul 载体 14.0ul Liagse 2.0ul
具体实验步骤 • IV. DNA片段的体外重组与转化 • 加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。 • 将EP管放入金属浴当中16度连接过夜。
具体实验步骤 • IV. DNA片段的体外重组与转化 • 1.从液氮中取出感受态细胞，，完全融化后，用移液枪将连接产物加入感受态细胞中，温柔混匀，在冰上放置半个小时。 • 2.42OC热激90sec。再在冰上放10min，然后导入SOC（1.5mlEP管）中，在37OC摇床上200rpm进行振荡一小时。 • 3.在这段时间里可以准备平板，25ml左右加了抗生素的60度左右的LB固体培养基倒入事先灭菌的培养皿中，在表面涂布上X-gal和ITPG; • 4.取出摇得菌液在离心机上6000转每分钟离心五分钟。然后将大部分培养基倒出，剩余大概五十微升左右的SOC即可。注意不可将沉淀倒出。 • 5.用移液枪将沉淀吹散均匀，将其加入事先倒好的平板上，加入涂布玻璃珠进行涂布。涂布均匀后将平板倒置放于37OC培养箱内过夜培养。第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆：
具体实验步骤 • V. 克隆的筛选与鉴定 1.用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养； 2.EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。
试剂盒质粒回收过程 • 把过夜培养菌液，10000r/min离心1分钟，倒掉上清液； • 向菌体中加入质粒回收试剂盒中的SolutionI400微升，震荡，直到沉淀的菌体完全悬浮； • 然后加入400微升的SolutionII，轻轻地颠倒混匀，然后在室温下放置2分钟； • 加入525微升的SolutionIII，颠倒混匀，直到出现白色的絮状沉淀，10000r/min离心10分钟； • 把上清液转移到试剂盒专用管中，10000r/min离心1分钟; • 倒掉溶液，向管子中加入600微升的buffer HB，10000r/min离心1分钟； • 倒掉溶液，加入750微升的wash buffer, 10000r/min离心1分钟; • 重复上一步骤7次； • 倒掉溶液后空转一次，以尽量除尽残余的wash buffer ; • 将带有膜的管子转移到新的EP管中，加入100微升的水，静置1分钟，10000r/min离心1分钟，即得到所需要的质粒。
具体实验步骤 • V. 克隆的筛选与鉴定 • 3.对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆，否则是假阳性的。
A B Toc33基因片段的凝胶电泳图谱 A.DL-2000Marker，B.Toc33
具体实验步骤 • VI.序列分析 • 最后，获得的阳性单克隆送样测序，测序结果的同源性比较采用GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比较运用DNAsist软件。
思考题： • 每一步观察到什么现象？解释之。 • 每组的测序结果是否一样？讨论。
主要参考文献 • 林宏辉 赵云 王茂林 陈放。 现代生物学基础实验指导。四川大学出版社，2002.8 • 颜子颖，王海林译，《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，1998。 • 魏群主编，《分子生物学实验指南》，高等教育出版社，1999。
