125 I- 氯丙嗪酪胺测定大鼠纹 状体神经细胞 D 2 受体的初探

2. 125I-氯丙嗪酪胺测定大鼠纹状体神经细胞D2受体的初探125I-氯丙嗪酪胺测定大鼠纹状体神经细胞D2受体的初探

3. 中南大学湘雅医学院 实验核医学研究室 陈检芳

4. 放射性碘标记的蛋白、多肽及单克隆抗体应用已广泛用于科研和临床检测试剂盒，但标记小分子物质如氯丙嗪未见报道。本研究采用放射性碘标记精神抑制药物氯丙嗪测定大鼠纹状体神经细胞D2受体得到颇为满意的结果，现报道如下：放射性碘标记的蛋白、多肽及单克隆抗体应用已广泛用于科研和临床检测试剂盒，但标记小分子物质如氯丙嗪未见报道。本研究采用放射性碘标记精神抑制药物氯丙嗪测定大鼠纹状体神经细胞D2受体得到颇为满意的结果，现报道如下：

5. 一、材料与方法 1、Iodogen(1、3、4、6-四氯、3α、 6α、二苯甘脲)（sigma），用二氯 甲烷制成每20μl含5μg的Iodogen 涂于0.5ml 的Eppendorf 管底壁， 氮气吹干，置4 ℃冰箱内备用。

6. 2、氯丙嗪酪胺合成（简称CPZ-TA） 氯丙嗪（Chlorpromazine CPZ）+ 酪胺（Tyramine TA） ↓ 溶于50μlN´N-二甲基酰胺 ↓冷却 加二环已碳二亚胺（DCCI） ↓ 室温反应17hr ↓ 冷冻干燥 ↓ 200μl甲醇复溶 ↓

7. ↓ 点样硅胶板上层析（展开剂为甲醇：甲酸=80:1） ↓ 刮下R f值为0.156的区带 ↓ 甲醇提取（8ml） ↓ 减压干燥 ↓ 层析纯的氯丙嗪酪胺合成物

8. 3、125 I-CPZ-TA的标记： 精取CPZ-TA 1mg 溶于1ml二甲基酰胺中 （即成1μg /μl） 移30μg/30μl置涂有Iodogen 的 Eppendorf 管内 磁力搅拌 加125 I 2mci反应4min

9. 上柱（SephadexG50） 用0.5MPB缓冲液（PH7.4）洗脱 收集各组份淋洗液 测定各组份CPM值

10. 4、多巴胺D2膜受体制备： 取体重250±30g的正常SD大鼠、乙醚麻醉、断头处死后于冰上迅速剥离颅骨，取双侧纹状体，称重后按1:10（W/V）比例，加预冷的50mmol/L Tris-HCL缓冲液（PH7.4），玻璃匀浆器匀浆（置冰浴中操作），匀浆于500g·min－1

11. 4℃离心10min，取上清，20000g·min－1，4℃离心20min，弃上清、取沉淀用预冷的50mmol/L Tris-HCL缓冲液按1:15（W/V）比例悬浮，混匀，再重复上述步骤一次。沉淀用1ml反应液悬浮，置－82℃保存备用。

12. 5、多巴胺D2受体与放射配基结合分析： 总结合管饱和浓度设5个点（复 管），每管加Tris-HCL复合反应液 （PH7.4）180μl，蛋白膜20μl （约150μg），非特异结合管加 Tris-HCL复合反应液80μ1、膜蛋 白20μ1（约150μg），

13. 氯丙嗪100μ1（200nmol·L－1）， 各管均加125I-CPZ-TA 50μl （终浓度分别为0.2、0.4、1.2、2.4、4.8nmol·L－1），振匀后，置25℃水浴25min，各管加2ml冷Tris-HCL复合反应液终止反应，立即用纤维滤膜

14. 过滤收集结合蛋白，计数各管CPM值，绘制饱和曲线，以 B/F对 B 作Scatchard图，计算 Bmax和kd值。 6、膜蛋白含量采用Lowry法分析（mg·ml－1）表示。

15. 二、结果 1、125 I-CPZ-TA分离纯化 用Iodogen法标记CPZ-TA标记液经 Sephdex G50柱（1cm×20cm）层 析纯化的结果，见图1。

17. 图1的结果表明：用Iodogen法 碘标记CPZ-TA经Sephdex G50柱 层析时只见2个峰，Ⅰ峰和Ⅱ峰，且明显分开，未见有聚合损伤峰出现，Ⅰ峰的放射性活度占总放射性活度的83.58%。

18. 2、正常SD大鼠纹状体D2受体与配体结合分析 125I-CPZ-TA与SD大鼠纹状体多巴 胺D2受体蛋白的结合，见表1。饱和曲 线图，见图2，受体数目Scatchard图， 见图3。

19. 表1 125I-CPZ-TA与SD大鼠纹状体多巴胺D2受体的结合

22. 三、讨论 人及动物脑功能的研究，一直为人 们所关注。经研究证明多巴胺能系统 的某些改变可导致人和动物的精神运 动性障碍，平衡及运动协调能力下降 等疾病的发生。根据文献报道，

23. D2受体基因位于第11号染色体长臂 上，在脑内尾状核、豆状核、伏隔 核、嗅球中表达最高。精神分裂症患 者纹状体密度增高，提示D2受体可能 与精神分裂症的发病机制有关。

24. 氯丙嗪能阻断多巴胺2（D2）受体， 是一种多巴胺拮抗剂。并且与D2受体 的亲和力很高，在多巴胺D2受体的研 究中，以往常采用3H-spiperone 等 作放射性受体的结合分析的配基，

25. 由于该试剂需进口，费用昂贵；而且 在分析测定中的条件也受到一定限 制。本研究采用Iodogen法碘标记氯 丙嗪对正常大鼠纹状体多巴胺D2受体 进行定量分析测定，测定数据较稳定，

26. 为一较理想的研究指标，这项工作的 开展将对多巴胺D2受体的研究提供极 大方便。

27. 谢谢