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实验六 细胞组分的分离与鉴定

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实验六 细胞组分的分离与鉴定

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  1. 实验六 细胞组分的分离与鉴定

  2. 一、实验目的 • 了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离 细胞组分的原理及过程。 • 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。

  3. 二、实验内容 ㈠实验原理 细胞内各种结构的比重和大小都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不同介质和不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。 此法是通过组织细胞匀浆、分级分离(密度梯度离心或差速离心)和分析三个步骤完成的。

  4. 1.差速离心(differential centrifugation) 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核蛋白体。 速度逐渐提高,样品按大小先后沉淀

  5. 2.密度梯度离心(density gradient centrifugation) 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。

  6. ㈡实验方法 1. 处死家兔:耳缘静脉空气栓塞法 • 2. 制备肝细胞匀浆: • 家兔处死后,立即剖腹取肝,迅速浸入预冷的 生理盐水中洗去血污,用滤纸吸干。 • 按每克肝重加9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液匀浆 化。(20g×9ml/g=180ml) • 用八层纱布(先用少量蔗糖液湿润),过滤匀 浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片,做好标 记,自然干燥。

  7. 3.差速离心法分离细胞器 • 低速离心分离细胞核 每组取10ml滤液,3000r/min离心10min,制备一张上清液涂片,做好标记,自然干燥。 吸去上清,用10ml 0.25 mol/L 蔗糖液悬浮沉淀物,用吸管混匀,配平后以3000r/min离心10 min。吸去上清液,加入0.5ml蔗糖溶液,用吸管吹打成悬液,制备一张涂片,做好标记,自然干燥。 • 高速离心分离线粒体

  8. 4. 分析 将干燥后的三张涂片浸入95%乙醇5 min,晾干。在涂膜部分滴加数滴甲基绿-派洛宁染液染色20 min,再以纯丙酮分化20s,蒸馏水漂洗,直立于吸水纸上吸干水分。 在高倍显微镜下比较观察三张涂片。细胞核被染成蓝绿色,核仁和细胞碎片染成淡红色。