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Glicosilación, fosforilación y otras modificaciones covalentes de proteínas

La secuencia de aminoácidos de la proteína no siempre refleja la secuencia contínua de nucleótidos en el genoma. splicing de pre-mRNA (eliminación de intrones). splicing alternativo (varios polipéptidos a partir de la misma secuencia de DNA).

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Glicosilación, fosforilación y otras modificaciones covalentes de proteínas

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Presentation Transcript


  1. La secuencia de aminoácidos de la proteína no siempre refleja la secuencia contínua de nucleótidos en el genoma • splicing de pre-mRNA (eliminación de intrones) • splicing alternativo (varios polipéptidos a partir de la misma secuencia de DNA) • corrimiento del marco de lectura (translational frameshifting) • edición del mRNA • splicing de proteínas (eliminación de inteínas) • procesamiento proteolítico de polipéptidos(en algunos casos se obtienen productos alternativos en diferentes tipos celulares) • Glicosilación, fosforilación y otras modificaciones covalentes deproteínas

  2. los RNAs pueden procesarse de diferente manera eliminando parte del producto de transcripción original

  3. splicing alternativo del gen de calcitonina

  4. RNA editing

  5. Edición de mRNA

  6. UGA C UGA GAC RF2 RF2 Pausa Unión de RF2 terminación de la traducción Frameshift (UGAC se lee como GAC y sigue +1)

  7. Corrimiento del marco de lectura Translational frameshifting HIV The group antigens form the viral core structure, RNA genome binding proteins, and are the major proteins comprising the nucleoprotein core particle. Reverse transcriptase is the essential enzyme that carries out the reverse transcription process that take the RNA genome to a double-stranded DNA preintegrate form

  8. integrasa RNAsa p10 Transcriptasa reversa p50 Proteasa p10 p55 proteasa

  9. Modificación de proteínas 1. las proteínas sufren modificaciones post-traducionales (y co-traduccionales) 2. la actividad biológica puede depender de las modificaciones 3. la espectrometría de masas es uno de los mejores métodos para identificar las modificaciones

  10. Protein Post-translational Modifications 1. Folding and Processing of Proteins -During translation proteins fold as they exit ribosome -Some proteins can assume native 3D structure spontaneously -Other proteins may require chaperones

  11. Protein Post-translational Modifications 2. Amino-terminal and carboxyterminal modifications -Cleavage of f-Met from bacterial proteins or Met from eukaryotic proteins. Other amino acids may be trimmed as well. -Acetylation of Met or other N-terminal amino acids -Removal of signal peptide for secreted or membrane proteins -Removal of C-terminal amino acids.

  12. Protein Post-translational Modifications 3. Modification of Individual Amino Acids a. Phosphorylation -Enzymatic reaction by specific kinases - Usually on Ser, Thr, Tyr

  13. 3. Modification of Individual Amino Acids b. Carboxylation Addition of extra carboxyl groups to Asp and Glu c. Methylation Addition of methyl groups to Lys and Glu • Protein Post-translational Modifications

  14. Protein Post-translational Modifications 3. Modification of Individual Amino Acids d. Isoprenylation -Addition of an isoprenyl group to a protein at either the C-terminus or the N-terminus -Derived from pyrophosphate intermediate in cholesterol biosynthesis

  15. Protein Post-translational Modifications 3. Modification of Individual Amino Acids e. Addition of prosthetic groups Covalently bound prosthetic group – required for activity Example: Cytochrome C -- Heme group

  16. Protein Post-translational Modifications 3. Modification of Individual Amino Acids f. Proteolytic Processing Some types of proteins are synthesized as a larger, inactive precursor protein and must be cleaved for activity g. Formation of disulfide bonds -Spontaneous cross-linking at Cys residues -Brought into proximity by folding -Helps to stabilize 3D structure

  17. Protein Post-translational Modifications 3. Modification of Individual Amino Acids h. Glycosylation -Addition of oligosaccharides to proteins -Usually at Asn -Sugars are transferred from dolichol-P -Present in ER

  18. Protein Post-translational Modifications 4. Methods to Discover Modifications a. Enzymatic methods Phosphatases – remove phosphate groups Glycosylases – remove carbohydrates b. Physical methods 1. Hydrolysis in 6N HCl – amino acid composition 2. Digestion with specific protease or chemical agent 3. Sequence of peptide by Edman Chemistry 4. Mass Spectrometry (MALDI-TOF)

  19. procesamiento proteolítico insulina: sobre-simplificación

  20. Rutas de procesamiento alternativas de la prohormone pro-opiocortina Alternative processing pathways of the prohormone pro-opiocortin. The initial cleavages are made by membrane-bound proteases that cut next to pairs of positively charged amino acid residues (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys, or Arg-Arg pairs), and trimming reactions then produce the final secreted products. Different cell types contain different processing enzymes, so that the same prohormone precursor can be used to produce different peptide hormones. In the anterior lobe of the pituitary gland, for example, only corticotropin (ACTH) and b-lipotropin are produced from pro-opiocortin, whereas in the intermediate lobe of the pituitary, mainly a-MSH, g-lipotropin, b-MSH, and b-endorphin are produced.

  21. Protein Splicing http://soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes/inteins.gif T. littoralisis the source of vent DNA polymerase, used extensively in PCR. When scientists at New England Biolabs cloned the gene for the enzyme, they were surprised to find that it contains an extra sequence of non-DNA-polymerase. They assumed it was an intron, but found that the mRNA isn't spliced and the extra sequence is translated into a novel domain in the enzyme. This polypeptide domain is a peptidyltransferase that specifically splices itself out of the DNA polymerase, rejoining the 2 parts of the DNA polymerase as it leaves. This protein-splicing reaction is remarkably analogous to RNA-splicing by introns, and so it's called an 'intein' (intervening protein). Once the intein has removed itself from the DNA polymerase, it has another activity - it is a transposase. This enzyme cleaves DNA specifically at the ends of the intein-encoding sequence and directs a DNA repair process that results in the insertion of the intein DNA into other protein-encoding genes - in other words, the intein DNAis also a transposon.

  22. Protein splicing

  23. proteínas de secreción:la vía secretoriasecretory pathway

  24. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS EN EUCARIOTES: SEÑALES DE LAS PROTEÍNAS QUE DETERMINAN SU DIRECCIONAMIENTO CELULAR.

  25. "for the discovery that proteins have intrinsic signals that govern their transport and localization in the cell" Günter Blobel USA Rockefeller University New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1999

  26. Signal hypothesis 1971:“Las proteínas secretadas al espacio extracelular contienen una señal intrínseca que las dirige hacia y a través de las membranas”

  27. La traducción de poly(A) mRNA de células de mieloma (principalmente mRNA de IgG) en un sistema libre de células carente de vesículas microsomales genera una proteína 2-3kDa mayor. • El mapa peptídico indica que la extensión se encuentra en el amino terminal Milstein, C. et al., Nature New Biology 239: 117-120, 1972 Signal hypothesis

  28. preparación de microsomas

  29. Experimentos utilizando microsomas Las proteínas del lumen de los microsomas no son atacadas por proteasas

  30. Descubriendo cómo trabaja la secuencia señal…

  31. Dobberstein and Blobel, 1975

  32. La secuencia señal es hidrolizada en el lumen del ER La secuencia señal dirige la proteína al microsoma. Este proceso es una translocación co-traduccional Descubriendo cómo trabaja la secuencia señal…

  33. Signal hypothesis 1975: • “La señal consiste en una secuencia de aminoácidos que forma parte integral de la proteína” • “La proteína atraviesa la membrana mediante un canal”

  34. Las proteínas destinadas para lasecrecióno incorporación alER, Golgi, lisozomao membrana plasmáticason sintetizadas en ribosomas asociados a membrana y transferidas al RER durante su síntesis Ruta secretoria

  35. ¿Qué elementos son requeridos para entrar a la ruta secretoria? • Una señal en la proteína • Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta • Una maquinaria de translocación, un canal • Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína

  36. Estructura de la partícula de reconocimiento de señal “signal recognition particle” (SRP)

  37. Una señal en la proteína • Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta • Una maquinaria de translocación (un canal) ¿Qué elementos son requeridos para entrar a la ruta secretoria? • Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína

  38. La hidrólisis de GTP potencia el transporte al ER

  39. Direccionamiento al lumen del ER

  40. Anclaje a membrana

  41. Topología de proteínas integrales de membrana sintetizadas

  42. Una secuencia interna topogénica dirige la insersión de algunas proteínas de transmembrana

  43. Se requieren múltiples secuencias topogénicas para las proteínas de transmembrana de pasaje múltiple

  44. Espacio extracelular Overview de la ruta secretoria trans Golgi Cis Golgi RE rugoso

  45. La N-glicosilación de las proteínas comienza en el ER

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