第六章原生质体培养与诱变

第六章 原生质体培养与诱变

1、原生质体的概念及培养的意义 概念：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体意义：（1）植物原生质体，具有再生完整植株的能力。（2）为细胞融合研究提供了可能。有可能产生异源杂交新品种。（3）由于除去了细胞壁，降低了细胞的DNA酶活性，从而有助于外源DNA的进入。为再生成具有新性状的植物体提供有利条件。（4）是开展遗传理论研究的材料

一、植物原生质体的制备 • 原生质体材料来源 • 原生质体的分离 • • 原生质体的纯化

1. 原生质体材料来源 ★ 植物叶片－取材容易－比较容易用酶解法分离 ★ 植物根尖组织－可由各种植物的种子萌发后取得 ★ 植物花粉－产生单倍体原生质体 ★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞－细胞壁容易解离

2、原生质体的分离 ★ 机械分离法－先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。－优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。－缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。

★ 酶解分离法 –常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等 –优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 –缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的活力。 • 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。

3.原生质体的纯化 •去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细胞器及其他碎片等杂质 A、过滤法 B、漂浮法 C、离心法

Protoplast • 采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll,Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。 • 优点： • 可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。 • 所用药品简单，成本低。 • 缺点及补救措施： • 对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。飘浮法

过滤法 • 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 • 优缺点： • 纯化原生质体比较简单。 • 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。

又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。 • 优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。 12mL 0.45M甘露醇碎片带碎片带含原生质体带 0.6mL0.45M蔗糖不连续梯度法

例: 烟草叶肉细胞原生质体的分离

原生质体鉴定 • 低渗爆破法 • 荧光增白剂法(calcoflower white 0.01%) • (荧光增白剂ob,cxt,cbs,366nm荧光下细胞壁呈黄绿色)

原生质体活力测定 • 形态识别形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。

原生质体活力测定 • 荧光显微镜识别(FDA法) FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。使用浓度：0.01%

原生质体活力测定 • 酚藏花红染色法（0.1%) • 酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 • 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) • 有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。 • 氧电极法，渗透压法，胞质环流法

原生质体培养方法

原生质体再生过程 • 原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。

•细胞壁再生： – 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。 • 细胞分裂形成细胞团： –一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。 •器官形成植株再生： – 从愈伤组织诱导发生 – 胚状体发育

原生质体变异 •自发突变 •原生质体诱变

第六章 原生质体培养与诱变