MACAM-MACAM UJI TOKSIKOLOGI

1. MACAM-MACAM UJI TOKSIKOLOGI ESTI DYAH UTAMI, M.Sc., Apt.

2. UJI KETOKSIKAN AKUT

3. UJI KETOKSIKAN AKUT • Dirancang utk menentukan efek toksik suatu senyawa (ex : zat tambahan makanan) yang akan terjadi dalam waktu singkat setelah pemejanan/pemberiannya dengan takaran ttt. • Tujuan : - Mempelajari potensi ketoksikan - Mempelajari gejala klinik/toksik yg timbul - Mempelajari mekanisme kematian subyek uji • Sasaran : - wujud efek toksik - potensi ketoksikan akut - mekanisme kematian hewan uji - angka kematian  LD50

4. Tatacara Pelaksanaan • PemilihanHewanUji  min 2 jenishewan (roden:tikus, mencit, kelinci; &nirroden:anjing, kera), baikjantanataubetina  Satugalur, dewasa, sehat, beratseragam (variasiygdipbolehkn 10%) • PengelompokanHewanuji  dibagimenjadibeberapakelompoksesuaiperingkatdosisygdigunakan (biasanya 4 klmpok) + 1 kontrolnegatif. Satukelompokterdiri 4-5 ekor • PemejananDosissediaanuji  Dosisygdiberikan min 4 peringkatdosis, berkisardosistertinggiygmnyebabkan 0% kematian; sampaidengandosisterendah yang yangmematikanseluruh/hampirseluruhhewanuji. • Pengamatan Lama pengamatan 24 jam, kecualipadakasusttt (tidakadakematian) dptdilanjutkansampai 7-14 hari. Pengamatanmeliputigejalaklinis yang timbul, perubahan BB, jumlahhewan yang matitiapkelomp, data histopatologibeberapa organ penting

5. Analisis & Evaluasi Hasil • Ada 3 metode utk analisis perhitungan LD50 : # Metode Grafik Lithfield # Metode kertas grafik probit logaritma Miller&Tainter # Metode rata-rata bergerak Thomson Weill  Didasarkan pada kekerabatan peringkat dosis dan % hewan yang menunjukkan respon • Evaluasi Hasil : - Data gejala klinis (kualitatif)  evaluasi penyebab kematian - Data pemeriksaan histopat  spektrum efek toksik - Data jml hewan yg mati (kuantitatif)  mhitung LD50  menetukan potensi ketoksikan akut senyawa uji

6. Manfaat Uji Ketoksikan Akut • Harga LD50 dpt digunakan utk menentukan peringkat/kategori potensi ketoksikan akut suatu senyawa  sgt toksik bila dosis kecil sj bisa menimbulkan kematian. (LD50 bukan ukuran batas aman!!) • Potensi ketoksikan (LD50) bersama potensi keefektifan (ED50)  evaluasi batas aman suatu senyawa/indeks terapi = LD50/ED50  batas keamanan uji tox : KETT (kadar efek toksik terkecil) atau NOEL (No Observe Adverse Effect Level) • Pengetahuan ttg potensi ketoksikan  dimanfaatkan utk merancang uji ketoksikan subkronis/kronis atau dosis awal/dosis terapi penelitian yg lain (5-10% LD50)

7. UJI KETOKSIKAN SUBKRONIS

8. UJI KETOKSIKAN SUBKRONIS / SUBAKUT • Uji ketoksikan suatu senyawa yg diberikan dg dosis berulang pada hewan uji ttt, selama < 3bln • Tujuan : - Mengetahui spektrum efek toksik suatu senyawa uji - Mengetahui apakah spektrum efek suatu senyw berhub dg takaran/dosis - Mengetahui harga NOEL (dosis tertinggi yg tdk menimbulkan efek toksik) - Mengetahui reversibilitas spektrum efek toksik yg terjadi • Sasaran : - hispatologi organ (organ yg terkena efek toksik) - gejala-gejala toksik - wujud efek toksik (kekacauan biokimia, fungsinal, struktural) - sifat efek toksik - Batas keamanan toksikologi terutama KETT

9. Tatacara Pelaksanaan • Pemilihan Hewan Uji  dpt digunakan roden (tikus) dan nirroden (anjing)  pilih hewan yg pola metabolisme mirip manusia, dewasa, sehat, jantan atau betina. Jumlah min 10 ekor utk masing-masing jenis kelamin dlm setiap kelompok takaran dosis. • Pengelompokan Hewan uji  min 4 kelompok (3 kelompok dosis & 1 kontrol negatif)  regresi min 3 data (analisis hub dosis-efek ) • Pemejanan Dosis sediaan uji  Dari dosis yg sm skali tdk menimbulkan efek – dosis yg betul2 menimbulkan efek toksik nyata. Min 3 peringkat dosis, syarat : dosis tertinggi sebisa mungkin tdk mematikan hwn tapi mberi efek toksik yg jelas; dosis terendah setingkat dg ED50. • Pengamatan # Wujud efek toksik/spektrumnya, semua jenis perubahan diamati : - Perub Fungsional : pengamatan hematology (Leukosit, Eritro, Hb, dll) - Perub Biokimia : pengamatan kimia darah & urin - Perub struktural : pemeriksaan hispatologi seluruh organ # Kondisi hewan uji (max 3 bln)  jml makanan&minuman, perubahan BB # Sifat efek toksik  pengamatan sekitar 2 bln kedepan setelah pemberian senyawa uji dihentikan

10. Analisis, Evaluasi Hasil & Manfaat • Data BB, asupan makanan&minuman, gejala2 klinis  evaluasi status kesehatan & perkembangan patologi hewan uji akibat pemberian sediaan uji • Hematologi darah&urin  evaluasi perubahan fungsional sistem organ • Manfaat : menentukan NOEL  menggambarkan batas keamanan secara sub kronis

11. Manfaat Uji Ketoksikan Akut • Harga LD50 dpt digunakan utk menentukan peringkat/kategori potensi ketoksikan akut suatu senyawa  sgt toksik bila dosis kecil sj bisa menimbulkan kematian. (LD50 bukan ukuran batas aman!!) • Potensi ketoksikan (LD50) bersama potensi keefektifan (ED50)  evaluasi batas aman suatu senyawa/indeks terapi = LD50/ED50  batas keamanan uji tox : KETT (kadar efek toksik terkecil) atau NOEL (No Observe Adverse Effect Level) • Pengetahuan ttg potensi ketoksikan  dimanfaatkan utk merancang uji ketoksikan subkronis/kronis atau dosis awal/dosis terapi penelitian yg lain (5-10% LD50)

12. UJI KETOKSIKAN KRONIS

13. UJI KETOKSIKAN KRONIS • Serupa dg uji ketoksikan sub kronis. • Perbedaan : lamanya pemberian / pemejanan takaran dosis senyawa uji. • Pengamatan selama masa hidup hewan uji  pilih hewan yg masa hidupnya pendek • Manfaat : mengevaluasi kemungkinan potensi terjadinya tumor/kanker pd hewan uji  dilanjutkan ke uji karsinogenik

14. UJI POTENSIASI

15. UJI POTENSIASI • Tujuan : Utk meneliti kemungkinan terjadinya peningkatan efek toksik suatu senyawa dg hadirnya senyawa yang lain, dimana terdapat kemungkinan akan menaikkan ketoksikan salah satu senyw. • Sasaran : Menentukan potensi ketoksikan akut (LD50) gabungan senyawa.

16. Tatacara Pelaksanaan • Pemilihan Hewan Uji ~ Uji Ketoksikan Akut • Pengelompokan Hewan uji ~ Uji ketoksikan akut. Bedanya : pengelompokan lebih dari 1 senyawa  masing2 senyawa diuji sendiri2 dlu, baru diuji gabungan kedua senyawa • Pemejanan Dosis sediaan uji ~ Uji Ketoksikan Akut • Pengamatan ~ Uji Ketoksikan Akut

17. Analisis & Evaluasi Hasil • Diperoleh data potensi ketoksikan akut masing2 senyawa dan gabungan senyawa • LD50 senyawa gabungan dibandingkan dg LD50 senyw tunggal  bila LD50 kombinasi << drpd senyw tunggal  berarti terjadi potensiasi (peningkatan potensi ketoksikan) • Ex : LD50 senyw A = 500 mg  LD50 senyw A+B = 200 mg

18. Manfaat Uji Potensiasi • Utk evaluasi senywa kombinasi  byk obat di pasaran yg terdiri > 1 macam senyawa; resep dokter biasanya obat kombinasi  perlu evaluasi apakah tdpt kemungkinan peningkatan efek toksik suatu senywa akibat senyw lain • Bila terjadi potensiasi  senyawa tsb jgn digunakan

19. UJI KETERATOGENIKAN EstiDyahUtami, M.Sc., Apt

20. Tujuan • Untuk mengetahui kemungkinan munculnya cacat bawaan pada janin yang dikandung oleh induk yang sedang bunting akibat pemberian suatu senyawa tertentu

21. Sasaran • Wujud efek toksik yang berupa : • Cacat makroskopis, misalnya munculnya sumbing, cacat celah langit, kelengkapan tangan dan kaki • Cacat mikroskopis • Cacat rangka/skeletal/tulang

22. Tata Cara Pelaksanaan Hewan uji berupa roden/nirroden. Ciri hewan uji yang bisa dipergunakan : • Hewan betina yang mempunyai daur etrus teratur. Kenapa? Karena hewan yang mempunyai daur etrus teratur maka kemungkinan terjadinya kehamilan bila dibuahi > 90% • Hewan yang anaknya banyak, karena kaitannya nanti dengan analisis statistik yang digunakan, salah satunya dengan Chi Square dengan minimal jumlah yang diperbandingkan minimal 30

23. Harus yang masih perawan, karena untuk menghindari timbulnya cacat spontan yang mudah timbul pada hewan yang pernah melahirkan • Dan yang terpenting hewan uji tersebut harus sehat

24. Pengelompokan • Minimal 3 kelompok (3 peringkat dosis) dan 1 kontrol negatif. Kenapa 3 kelompok? Karena nanti akan dianalisis hubungan dosis respon dengan regresi, jadi perlu min 3 titik untuk bisa membuat persamaan garisnya

25. Perlakuan • Senyawa uji diberikan pada masa organogenesis, karena pada saat itu organ2 janin sedang berkembang, jadi kalau ada cacat mudah sekali terlihat. • Masa pengawinan hewan terutama roden yaitu pada sore hari (antara jam5-6) karena pada saat itu hewan dalam masa His (mudah terangsang)

26. Penetapan Masa Bunting • Dengan cara melihat adanya sperma pada vagina hewan betina, yaitu dengan apus vagina. • Proses penglihatan hal tersebut di atas harus cepat, jangan terlalu lama dari masa kawin (paling lambat keesokan paginya) karena jika terlalu lambat, sperma terlanjur hilang.

27. Dosis / Takaran • Minimal 3 peringkat dosis + 1 kelompok kontrol negatif • Yaitu tidak menimbulkan efek teratogenik sampai dosis yang menimbulkan efek teratogen 100% • Dosis tertinggi yang dipergunakan tidak boleh menimbulkan pengaruh negatif pada induknya, misal sedasi atau perubahan kelakuan • Dosis yang dapat menimbulkan teratogen bisa diperkirakan dari harga LD50 induk, yaitu sekitar ¼ - 1/3 LD50 induk

28. Pengamatan • Dimulai dari berakhirnya masa bunting hewan uji yaitu 12 – 24 jam sebelum kelahiran normal • Kenapa harus dilakukan bedah cesar? Karena biasanya hewan akan memakan anaknya yang lahir cacat

29. Yang diamati adalah : • Biometrika janin, meliputi resorpsi awal, resorpsi akhir, angka cacat, BB janin, dan panjang janin • Cacat makroskopis, yaitu pengamatan terhadap adanya cacat badan • Cacat mikroskopis, pengamatan histopatologi jaringan untuk melihat adanya cacat seluler • Untuk mengamati adanya cacat rangka/skelet, yaitu dengan pewarnaan alizarin. • Biasanya janin direndam dulu dengan basa/asam kuat untuk menghilangkan ototnya, kemudian tulang2nya diberi warna agar jelas terlihat

30. Analisis & Evaluasi • Dari data makroskopis dan mikroskopis dapat disimpulkan adanya cacat badaniyah, aborsi, cacat seluler, hingga kelainan rangka pada janin

31. Manfaat • Adalah untuk memberi label produk obat yang beredar di pasaran bahwa obat tersebut boleh/tidak dikonsumsi oleh wanita hamil terutama pada trisemester pertama

32. UJI KEMUTAGENIKAN EstiDyahUtami, M.Sc., Apt

33. Tujuan • Untuk melihat pengaruh suatu senyawa tertentu terhadap kode genetik, sehingga bila berpengaruh akan menimbulkan mutasi yang sifatnya menurun

34. Sasaran • Ada 2 jenis mutasi dan merupakan sasaran dari uji kemutagenikan, yaitu : • Mutasi tempat, berkaitan dengan perubahan susunan basa, asam amino, atau terjadi dalam pasangan nukleotida tunggal dalam molekul DNA • Mutasi struktur, berkaitan dengan perubahan dalam sistem kromosom (pecahnya kromosom, berubah secara kualitas dan juga kuantitas)

35. Tata Cara Pelaksanaan Secara in vitro : • bakteri (sel tunggal  identifikasi komponen genetiknya mudah) • Jumlah : 5 x 10 bakteri • Cara : bakteri diletakkan dlm cawan petri  pejani dg senyw uji  periksa perubahan genetiknya

36. Secara In vivo  ada 3 metode : • Metode Penetapan Letal Dominan • Utk mengetahui adanya mutasi tempat • Subyek uji : hewan jantan • Subyek dipejani senyw uji (dosis subtoksik)  kawinkan dg betina perawan  hari ke 14 di-cesar  periksa & hitung korpus luteum, resorpsi awal&akhir, jmlh tempat implantasi  hitung indeks mutasi • Indeks mutasi = resorpsi awal/implantasi total x 100

37. Metode Penetapan Inang Penengah • Perlu bakteri sbg indikator kerusakan/perubahan genetik pd mamamlia • Subyek dipejani i.p dg bakteri (Salmonella)  ambil cuplikan hayati dr rongga perut  ukur frekuensi munculnya mutasi bakteri • Utk evaluasi mutasi kromosom, struktural

38. Uji Sitogenetika • Senyawa uji dipejankan pd organ ttt hewan uji  periksa jaringan/ sel daro organ tsb • Sumsum tulang, limfosit, fibroblas, gametosit • Utk melihat mutasi struktural/kromosom

39. Manfaat • Utk mengevaluasi apakah senyawa yg dipakai oleh manuasia berefek menurun pd keturunannya atau tidak